小中大PCR 引物设计及软件使用技巧 [转自 丁香园论坛]
PCR 引物设计及软件使用技巧 [转自 丁香园论坛]
PCR 引物设计及软件使用技巧
张新宇，朱有康，高燕宁
（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）
摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上，详
细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性
引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。
关键词：PCR；引物设计
中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编号：
1
自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不
合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚
体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
使用问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避
免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即
错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度
（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性
(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex
formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的
GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，
引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延
伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导
致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增
加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配
位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应
当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反
应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC
含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种
方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest
neighbor method) [6][7]。
