小中大realtime pcr 个人经验分享
realtime pcr 个人经验分享
我一直在跟RNA提取、逆转录和SYBR GREEN realtime-PCR反应做斗争，现在已经告别当初的迷茫，当别人问自己的时候，也能说出个一二五来了，很高兴。当时在我艰难摸索的时候就想，等我都学会了，我一定要写篇帖子，把一个初学者最初的想法和觉得矛盾、困难、不知如何入手的方法、难点和最后解决的办法写出来，一来可以帮助更多像我这样的人，二来也算让自己有点成就感了，三就是希望版主给我加点分数了。呵呵。好了，现在开始吧。
1. ABI7000的仪器如何做溶解曲线：我们单位刚开始的时候只有一台仪器ABI7000，其他人都是用taqman探针做的，而且只是对结果进行定性分析。我用的是SYBR green 染料，是需要做溶解曲线的，关于设置的问题就来了，设置好PCR的程序以后，在程序下方有一个框框，具体我忘了，把那个框框打上勾就好了,溶解曲线的温度是不能高于60的，所以我的有部分产物解链温度太高了，出来的溶解曲线只能出来半侧峰或者没有峰。后来单位又购进了一台ROCHE 480 lightcycleR能设置溶解曲线的反应程序，这个问题就解决了。
2. 阈值的调整：一般设在最大荧光信号的1/5,或是R2最大时的CT值为阈值标准，根据不同的仪器选择。
3. 扩增效率的问题：lightcycle扩增效率在1.9-2.05之间认为结果是可以应用的，有可比性。其它仪器是90-105%，因为我没用过其它的仪器，有见过这种仪器类型的网友可以补充一下。
4. realtime pcr的重复性问题：通常相同试剂、相同模版、同一个反映条件CT不要相差一个循环以外。比如复孔。
5. 梯度稀释问题：将模版10倍稀释后，每个梯度CT值相差要控制在3.3-3.5个循环之间。
如果CT值超过30个循环以后，就不适宜做梯度稀释了，因为这个时候浓度太低，定量本来就不准，所以梯度稀释结果不能用作参考的。
6. 标准曲线：通常有些人做很多标本，要用不同的pcr反应板，不能同时一次进行，这时每个反应板最好做标准曲线，斜率相差小于0.1，结果可认为具有可比性。且扩增斜率要在-3.6到-3.1之间结果最好。当然了，这个时候因为每个板都做标准曲线了，分析的时候既可以用detadetaCT法，也可以用双标准曲线法了。
7. 如何理解标本做复孔的问题：原来我一直都不理解标本做复孔的问题，就是不知道怎么做，我以为是一个标本，在不同的反应板里做3次，取平均结果，同一个实验室里也没人做过的，后来问同学，才知道，在这里谢谢她了。
过程如下：20ul体系，比如说你要做10个标本，每个标本要做3个复孔，就先准备10*3+大约5个标本的母液（含酶、realtimepcr的试剂等，但不包括模板），然后准备10个500ul的pcr管，每个分装60ul。然后在分装好的母液中加入3ul的模版，混匀后再分装20ul到3个realtime反应孔中，这样就说传说的3个复孔了，避免了不同批次、加样等等误差。
[ 本帖最后由 miracle 于 2011-9-5 15:17 编辑 ]
