小中大个人看法
（1）经过PCR之后目的条带很暗，有很多种因素，就个人经历做如下推测：
1.模板浓度太高或者太低都能导致这种情况，模板浓度太高，在反应体系里可以导致变性后模板链碰撞，减少引物结合。还有就是抽提模板的时候提的不好，蛋白去除不干净或者含有很多抑制PCR反应的离子、分子和试剂残留，这时候你可以用PCR产物回收试剂盒纯化模板。
2.反应体系，镁离子的多少也能影响最终产率，引物的量。另外，常用的30微升和50微升体系也有差别，本人曾经用这两个体系扩增同样的模板，结果差别很大。建议是用随酶提供的建议体系先进行扩增。
3.反应程序，Tm值的确定，循环数，也能影响到最终产量。可以适当提高或降低温度试试，有时候引物需要的实际Tm值并不是引物单子里建议的Tm值。我们实验室常规做法是从Tm值入手，通过梯度PCR，确定合适的Tm值后，再进行其他因素的调节。
4.PCR仪器老化、实验过程中出现污染、引物浓度不对，片段过长时延伸、退火时间太短。
5.检测时上样量太少，检测时做的胶不好，扫胶仪的问题。
（2）二次PCR不能用原PCR产物直接作为模板，要稀释！稀释倍数依据你原产物的浓度来，如果很弱，可以稀释1倍，5倍，很亮，可以稀释10倍，20倍。
不一定增加模板就能解决问题。
如果本来目的条带就很暗，你再去做PCR产物回收，过程中再损耗一点，肯定是少得可怜了。
本人的看法和建议，你如果想通过PCR的方法解决问题，从1-5一个一个因素排除，如果你想快点拿到目的片段，可以考虑以下几个方法：
扩增，如果没有其他大片段的杂带，就去产物纯化，然后做克隆。
扩增，如果有其他大片段杂带，这时候你可以考虑多扩增几管同样的东西，然后合并，浓缩，切胶纯化，做克隆。
扩增，如果没有其他大片段的杂带，多扩增几管同样的东西，合并，浓缩，直接测序。
希望对你有所帮助！
