小中大终于把实验做完了，做的是相对定量法。想把自己做定量PCR写下来，和大家一起分享学习。
1、首先要确定引物的溶解曲线，最好的是一个峰，而且TM值在80度以上，有人说太低可能是D二聚体，但我做过82度的也有D二聚体，所以一定要把产物跑电泳才能确定引物的特异性。
產物的Tm并不規定一個標準的範圍，但儘量在80以上，主要還是要結合電泳結果來看。我做過Tm 79度的。
2、配引物一定要在无菌操作台里，因为定量PCR要求比较高，一点污染都会出现非特异性扩增，我就试过引物污染，阴性对照出现扩增曲线。
恩，磨刀不誤砍柴工。支持！
3、确定引物后要确定模板的浓度，我觉得说明书说的都不准，最好是自己调，把内参和目的基因的CT值调到8到26之间，最低不超过30，太高难以分辨，太低出现非特异性扩增，低的情况溶解曲线也变成多个峰。
這個，Ct在8肯定是不准的。ABI儀器自動生成閾值的計算方法是Ct 8-16。大的不要超過35最好，不過我做過Ct 38，電泳產物大小是正確的，數值也拿來用了。哎。
4、要做阴性对照，有人说阴性对照是不加引物，有人说是不加模板，我觉得是后者比较好一点。
陰性對照不加引物還是頭一次聽說。
5、一定要把PCR后的产物跑电泳，因为你机子分辨不了你的产物的大小。我试过溶解曲线很漂亮，但跑出来电泳多条带。
同感，我也遭遇過。很令人鬱悶、費解。
6、有条件就做标准曲线。
這個主要是看選擇什麽方法處理數據。
7、好的试剂和引物对你的实验帮助大，假如做3次曲线不漂亮，建议换引物或者试剂，定量PCR的引物设计要求比普通PCR的高，建议让专业设计，我的是在宝生物设计的，不错。
定量引物和普通引物設計上各有側重，不能籠統的說要求孰高孰低哈，沒有最好的，只有最適合的，哈哈。
謝謝樓主分享經驗。
