求助：PCR电泳结果包括阴性对照都拖带

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标题:求助：PCR电泳结果包括阴性对照都拖带

夕阳[使用道具]
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发表于 2011-8-22 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助：PCR电泳结果包括阴性对照都拖带，同时没有出现目的条带[转自丁香园论坛]

我做的是巢式PCR，第一套用的退火温度是55，第二套是58，模板加1微升，35个循环，预变性94°5min,94°45s,55°45s,72°1min,延伸10min.

附件

2011-8-22 17:35

13762968_snap.jpg (16.88 KB)

2011-8-22 17:35

24536964.jpg (22.3 KB)

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-22 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很可能是模板加的太多了，完全过量了的结果

细水长流[使用道具]
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发表于 2011-8-22 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

模板加了一微升，并且是五倍稀释过的DNA，应该不算多吧？

细水长流[使用道具]
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发表于 2011-8-22 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-22 17:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
很可能是模板加的太多了，完全过量了的结果

模板加了一微升，并且是五倍稀释过的DNA，应该不算多吧？

嗡嗡[使用道具]
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发表于 2011-8-22 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果不是模板多，那很可能是电泳本身的问题，找一个肯定有条带的样本做对照，注意不是用ＬＡＤＤＥＲ，比如染色剂与ＤＮＡ量的问题，电泳缓冲液等

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-22 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢，我再试试，呵呵

蓝蜗牛[使用道具]
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发表于 2011-8-22 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是相同的情况，模板稀释过了，也尝试了多个上样量，还是不行。
引物重新稀释后，第一次PCR后电泳是成功的，但第二次又是拖带，师姐说是PCR条件不好，体系不稳定，让我重新摸条件，可是我做的是GAPDH，退火范围应当很宽，用的又是同一实验室成功扩增的条件。很困惑啊:P

飞天小鹿[使用道具]
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发表于 2011-8-22 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

阴性对照用水也拖尾，那就真的是总体条件不好了，PCR条件，所有东西都是。混合液的任一成分，反应程序，后期电泳。期间试剂储存混合使用等等。阴性对照是你的已知阴性样本的话再加上模版问题。总之一个一个试。要不就找做得熟的人做做。更换试剂。