求助：限制酶SexAI的保护碱基和定向克隆问题

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标题:求助：限制酶SexAI的保护碱基和定向克隆问题

阿福[使用道具]
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发表于 2011-8-23 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助：限制酶SexAI的保护碱基和定向克隆问题 [转自丁香园论坛]

大家好：
请问限制酶SexAI的保护碱基怎么加？我打算加4个“Gs”，这样可以么？SexAI的识别序列是ACCWGGT(W=A/T)。我准备用SexAI做定向克隆，所用载体上游SexAI序列是5‘-ACCAGGT-3’;，下游SexAI序列是5‘-ACCTGGT-3’;(同一条链上的序列，即都在sense strand上，即：5‘-ACCAGGT-------------ACCTGGT-3‘;)，那么我的上下游引物的酶切位点怎么加啊？是5’-ACCAGGT-3‘+上游引物，5’-ACCTGGT-3‘+下游引物？这样的话插入片段就有可能以任意一个方向插入，即有两种方向的插入片段。还是上下游引物用一样的SexAI序列即：5’-ACCAGGT-3‘+上游引物，和一样的5’-ACCAGGT-3‘+下游引物？这样好像又无法连接到载体上，只能连接一头。
谢谢！

果冻也酸[使用道具]
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发表于 2011-8-23 10:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

无论是上下游用不同序列的SexAI，还是用相同的SexAI，直接进行连接都可以，不过只有50%的机会得到顺序正确的序列。可以设计一对引物用于鉴定连接顺序。

这个酶切位点没有用过，你可以查一下公司的操作手册，会对这种酶有明确的解释。

PS：不能换别的酶切位点么

阿福[使用道具]
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发表于 2011-8-23 10:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 果冻也酸 于 2011-8-23 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
无论是上下游用不同序列的SexAI，还是用相同的SexAI，直接进行连接都可以，不过只有50%的机会得到顺序正确的序列。可以设计一对引物用于鉴定连接顺序。

这个酶切位点没有用过，你可以查一下公司的操作手册，会对这种酶有明确 ...

这个酶是为我的载体特意添加的，为的就是方便，不过我发现可能存在两种任意方向的连接，所以比较困惑，这样就会大大降低后面的转化效率，而我后面要用的转化方法是改进的方法，这样不就有影响了么。

阿福[使用道具]
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发表于 2011-8-23 10:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用不同序列的SexAI可以直接进行连接么？因为质粒双酶切（质粒上有两个不同序列的SexAI位点），酶切后形成的质粒两头的黏性末端是相同的（对么？原来这两个SexAI位点之间的序列就丢失了？），所以插入基因可以以任意一种方向连接，都会出现方向不正确和方向正确的序列。我有点陷进去了，大家帮我看是不是会产生两种方向的插入序列啊。

说明：两个SexAI位点分别位于质粒的两个MCS上，具体序列如下图所示：