简并引物设计方法（实际操作步骤）

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标题:简并引物设计方法（实际操作步骤）

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发表于 2011-8-23 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

简并引物设计方法（实际操作步骤） [转自丁香园论坛]

自己做过一些简并引物，现将我利用生物信息学资源设计简并引物的各个步骤作一个总结，各位战友可将各自的心得体会写下，以便大家交流！！！

一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列
因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。
二、对所找到的序列进行多序列比对
将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其结果入下图所示,所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。

附件

2011-8-23 15:28

85909684_snap.jpg (32.4 KB)

清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-8-23 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

三、确定合适的保守区域
设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。

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发表于 2011-8-23 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

四、利用软件设计引物
当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计（关于其的使用请见笔者的另一个帖子cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1')），将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差以个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T），该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。

清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-8-23 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2011-8-23 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

五、对引物的修饰
若得到的引物为：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度多高不利于pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库我以前发过大家搜索一下把）。
最后，这样子设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

王六六[使用道具]
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发表于 2011-8-23 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

~~~~~~~~~谢谢,很好!!

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-8-23 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主您好！请多指点！
我要用质谱得到的两个肽段设计简并引物和探针：
一、序列
肽段1：AHGFLPLTK（9肽）
肽段2：ATGGSAL（7肽）-本应19肽，取可信度最高的7个氨基酸
二、用Primer Premier 5 设计的简并引物：
肽段1
S 5’ GCN CAY GGN TTY YTN CCN YTN CAN A Tm 70.4
A3’ CGN GTR CCN AAR ANG GGN RAN TGN T GC% 52
肽段2
S 5’ GCN ACN GGN GGN WSN GCN YT Tm 73.4
A 3’ CGN TGN CCN CCN WSN CGN RA GC% 66.7
三、请问：
1、每个N 都用次黄嘌呤代替吗？
2、直接用物种偏好密码子替代多义碱基吗？
这是该物种的偏好密码子表：
Amino Acids Codons
1 2 3 4 5 6
AAla Alanine GCC (61.8) GCG (38.0) GCA (16.5) GCU (10.1)
CCys Cysteine UGC (6.9) UGU (1.7)
DAsp Aspartic acid GAC (35.7) GAU (19.6)
EGlu Glutamic acid GAA (26.5) GAG (25.7)
FPhe Phenylalanine UUC (27.7) UUU (4.6)
GGly Glycine GGC (54.8) GGU (15.3) GGG (7.9) GGA (5.6)
HHis Histidine CAC (13.7) CAU (6.6)
IIle Isoleucine AUC (36.6) AUU (6.6) AUA (1.8)
KLys Lysine AAG (30.2) AAA (7.1)
LLeu Leucine CUG (67.3) CUC (12.5) UUG (7.7) CUU (5.8) CUA (1.7) UUA (1.6)
MMet Methionine AUG (25.3)
NAsn Asparagine AAC (23.4) AAU (6.2)
PPro Proline CCG (31.4) CCC (10.2) CCA (4.9) CCU (3.0)
QGln Glutamine CAG (36.7) CAA (5.3)
RArg Arginine CGC (36.8) CGU (10.7) CGG (10.3) CGA (4.1) AGG (2.6) AGA (1.5)
SSer Serine AGC (21.7) UCG (15.2) UCC (10.7) AGU (4.4) UCU (2.5) UCA (2.4)
TThr Threonine ACC (38.6) ACG (12.0) ACU (3.5) ACA (3.3)
VVal Valine GUG (41.9) GUC (22.4) GUU (7.9) GUA (6.2)
WTrp Tryptophan UGG (12.4)
YTyr Tyrosine UAC (16.3) UAU (5.9)
STOP UGA (1.9) UAA (0.6) UAG (0.3

请您帮忙看一下好吗？发帖好几天了无人应助。。导师和同学也都不作这个。。快郁闷死了！
在线等！

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发表于 2011-8-23 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、次黄嘌呤的优点是能和四种碱基很好地配对，并且不降低引物可结合的靶序列的数目。不过次黄嘌呤的价格比较贵，可能要一百一个,如果钱多也无所谓啊，哈哈。
2、每一个aa对应的密码子都有一个出现的频率，根据你研究的物种的Ala对应有4种可能的密码子 GCC (61.8) GCG (38.0) GCA (16.5) GCU (10.1) ，根据每个密码子出现的频率你可以先从高的试起，比如Ala可以设计为GC(CG)，可能绘出很多条带，可以都割了区测序，关键要多是几次。实在不行建议以亚套方式合成引物库，可以参考《PCR技术实验指南》，科学出版社和张学敏《靶向新基因的克隆策略——理论与方法》军事医学科学出版社
祝实验顺利！！

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发表于 2011-8-23 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

衷心感谢qxkillgre的及时解答。请斑竹加分！
1.次黄嘌呤全部替代不现实阿。若选择性替代N是尽量靠近3‘端还是5’端？
2.手动设计后怎么对其进行评价和Blast？很多软件只提供特异性引物的评估。
3.查到了该物种的基因组序列。两个肽段的BLAST都与该物种的一假设蛋白
同源（尽管得分很低），是否可以利用这一信息进行尝试？
4.用偏好密码子替代G+C含量偏高。
5.据您的经验，哪家公司的简并引物和探针合成较好？
加您的qq或msn行吗？邮箱也行。设计好后想请您审核一下。

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发表于 2011-8-23 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、I一般替代在3'端，保证了3'引物和模板的结合才能保证pcr的进行。
2、看看两条引物的3'端有没有互补就行了，你只是要求出带，又不要图片多好看是发
3、不知道你是基于数目判定他们同源的，如果确实同源肯定要试一试啊
4、gc高可以尝试td pcr啊
5、我是在生工合成的

祝实验顺利！！

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