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标题:求助：现在PCR怎么跑不出来了？

兔纸[使用道具]
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发表于 2011-8-24 09:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：现在PCR怎么跑不出来了？

求助：现在PCR怎么跑不出来了？[转自 丁香园论坛]


这几天跑PCR真是很奇怪，刚开始每次都跑的好好的，试剂都没有换，程序也没有改，现在却每次都跑不出来了，真不知道是怎么回事，不知道各位遇到这种问题没有，望赐教！
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-8-24 09:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这样的问题我倒是遇到过,不知你的模板是cDNA还是基因组DNA?酶的保存条件?引物是否反复冻融了?不行的话,可以把产物稀释50倍,跑个二次.
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发表于 2011-8-24 09:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 阿福 于 2011-8-24 09:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这样的问题我倒是遇到过,不知你的模板是cDNA还是基因组DNA?酶的保存条件?引物是否反复冻融了?不行的话,可以把产物稀释50倍,跑个二次.

我用的是基因组DNA，酶是保存在-20度，引物确实经过反复冻融了。为什么要把产物稀释50倍了在试呢？这个有什么影响吗？
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发表于 2011-8-24 09:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是在跑酶切产物时有一段时间经常遇见,不过跑PCR产物倒没有遇到过.
后来发现是体系中酶浓度较高(虽然并没有超过常规用量),由于蛋白质与DNA结合,造成DNA滞留在孔里面.将loading buffer与产物充分混匀,甚至置37度孵育5min,情况得到了很好的改善.
会不会是你的体系里有教高浓度蛋白污染?
另外,稀释也是一个好方法.
试试吧  
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阿福[使用道具]
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 小中大
没有目的条带，可以把管子放回去，再加5-10个循环，还是没有的话，可以考虑稀释，如果不稀释的话，很容易出现smear现象，稀释50倍也只是经验，当然不一定就要稀释50倍，你也可以20、30、40或其它倍数，最好是有个梯度。引物反复冻融会影响PCR结果，我有这方面的教训。
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发表于 2011-8-24 09:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 阿福 于 2011-8-24 09:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
没有目的条带，可以把管子放回去，再加5-10个循环，还是没有的话，可以考虑稀释，如果不稀释的话，很容易出现smear现象，稀释50倍也只是经验，当然不一定就要稀释50倍，你也可以20、30、40或其它倍数，最好是有个梯度。引物反复冻融会影 ...


非常感谢你的回复，我稀释了50倍试过了仍然没有扩增出来，我怀疑是不是引物出问题了，但我的引物才用了不到一个月啊，真不知道是那里出了问题
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-8-24 09:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你这些方面都没有问题，那你可以试试换个模板。这种情况我们实验室也出现过这种情况，当时我们就用跑出来的产物作模板，继续跑，效果还好。
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发表于 2011-8-24 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这位朋友，我也遇到这种情况，最近PCR就是扩不出来！很是郁闷！我也试过将产物稀释后再扩，仍然没结果。
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 小中大


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原帖由 阿福 于 2011-8-24 09:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
没有目的条带，可以把管子放回去，再加5-10个循环，还是没有的话，可以考虑稀释，如果不稀释的话，很容易出现smear现象，稀释50倍也只是经验，当然不一定就要稀释50倍，你也可以20、30、40或其它倍数，最好是有个梯度。引物反复冻融会影 ...

这位朋友你好！！我现在已将循环次数增加到35个循环。也试将产物50倍，100倍，1000倍稀
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 小中大


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原帖由 阿福 于 2011-8-24 09:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
没有目的条带，可以把管子放回去，再加5-10个循环，还是没有的话，可以考虑稀释，如果不稀释的话，很容易出现smear现象，稀释50倍也只是经验，当然不一定就要稀释50倍，你也可以20、30、40或其它倍数，最好是有个梯度。引物反复冻融会影 ...

这位朋友你好！！我现在已将循环次数增加到35个循环。也试将产物50倍，100倍，1000倍稀释但仍没结果。请赐教！！
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