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标题:菌落PCR的准确性问题

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发表于 2011-8-24 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

菌落PCR的准确性问题

分析测试百科网[转自 丁香园论坛]


我做克隆鉴定，
分别做了菌落PCR、质粒PCR和酶切，
结果是菌落PCR阴性无条带，
质粒PCR阳性，条带很亮，
酶切阳性，条带比PCR暗一点儿，但也有目的带。

菌落PCR是否可信呢？
是不是菌液一定要经过裂解步骤才能做为PCR模板？
我是直接将摇的菌用1微升做模板，和质粒PCR一起P的。

附图一张，请高手指点。
共两个样儿，第一个样酶切和质粒PCR为阳性，第二个样全为阴性。
从左至右分别标号为1至9，
1、2号为质粒，
3、4号为酶切，
5、6号为菌落PCR，
7、8号为质粒PCR，
9号MARKER。


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2011-8-24 12:38
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幸福无罪[使用道具]
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发表于 2011-8-24 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先楼上兄弟作的阳性条带确实漂亮，羡慕！
你做的是菌液pcr而不是菌落pcr，菌落pcr是直接从板上挑取单菌落，进行pcr扩增。菌落pcr是可信的，菌液pcr一般情况下也是可信的。
菌液不需要经过裂解步骤就能直接做为PCR模板进行pcr扩增，当然你也可以煮沸菌液离心取上清作pcr。
你的菌液pcr的体系是多少体积？
如果体系很小的话，你加了1uL可能就是有点多了，因为菌液里面有培养基的成分，会对pcr反应有一定的影响，我曾经用过0.5uL的菌液做过20ul的体系，甚至只需要0.2ul的菌液就能扩出很亮的条带来。
还有一种可能就是你摇菌的过程污染了，长了杂菌，你用的菌液可能含有的是杂菌
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发表于 2011-8-24 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢你的回复：）
我改了PCR程序，之后扩出来很好的带，
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发表于 2011-8-24 12:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
更正一下，上面图的5、6号为质粒的，7、8为菌落的
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发表于 2011-8-24 12:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
菌液PCR阴性的原因我认为是培养液里盐的问题，如果洗涤几次就可以了。

我们的菌落PCR反应体系是
12.5ul 2xPCR mix(含buffer, dNTPs,Taq酶）
1ul上游引物=10pmol
1ul下游引物=10pmol
2ul 样品
8.5ul水

样品准备：tip挑菌落至含有10ul水的pcr管中，98度10分钟，vortex，flash centrifuge。取上清2ul做PCR。
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发表于 2011-8-24 12:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哦 有意思啊
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发表于 2011-8-24 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实，菌液PCR的最大的问题是假阳性，我就遇到过很多很多，假阴性还是第一次遇到，长知识了。  
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发表于 2011-8-24 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
恩，假阳性问题很严重，我们现在已经不用了
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