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标题:PCR测序有杂带,模板不纯怎么办?

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PCR测序有杂带,模板不纯怎么办?

PCR测序有杂带,模板不纯怎么办? [转自 丁香园论坛]


最近用以下引物PCR,测序时公司反馈模板不纯,有杂带,请问园中高手怎么改进?非常感谢!
基因A

F 5’ –GTG CTG CAG GTG TAA ACT TGT ACC AG-3’

R 5’ –CAC GGA TCC GGT AGC AGC GGT AGA GTT G-3’

基因B:

F 5’ –AGG ATC CCC GCA GAG GAT TTC GTG TAC CAG-3’

R 5’ –TCC TGC AGG ACG CTC ACC TCT CCG CTG CA-3’
反应体系(试剂采用的是Tiangen公司的Master Mix ),PCR循环条件:
94℃预变性3min,进行如下循环:94°变性30S
55°退火30S 72°延伸30-40s, 30个循环, 最后72°延伸5min
望各位高手指导啊,谢谢
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基因A和B的PCR体系和循环条件一样,
PCR体系:
DDH2O 12.0ul
2×Master Mix 15ul
AF (100ng/ul) 1ul
AR (100ng/ul) 1ul
DNA模板 1ul
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连T用菌液测吧
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原始峰图上来看看
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胶回收克隆,在测序,肯定就没有问题了
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海鸥crazy[使用道具]
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克隆怎么做?实在不懂,请教,O(∩_∩)O谢谢
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用低熔点胶,买个胶回收试剂盒,再买个克隆的盒子,照着说明做,没多少钱
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米米[使用道具]
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有位师兄曾经说,可以在PCR之前测一下浓度, PCR后再测一次, 看看前后260\280比值,明确是否模板不纯,如果确定是, 可以找操作过程中的失误, 实在不行, 重新提DNa。重做看看吧
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