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标题:关于引物设计

dreaming[使用道具]
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发表于 2011-8-24 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于引物设计

关于引物设计 [转自 丁香园论坛]


我需要设计一个长引物，不知道有没有什么要求？可不可以？大约70-80bp,其中有前面60bp与模板不同，这样能扩出来吗？希望高手指点！
如果不行的话，我先合成前面的60bp，连接到T载体，然后再将扩增的目的基因连
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嗨皮[使用道具]
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发表于 2011-8-24 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
位点突变的方法好象就是这样，做个MEGA PRIMER，应该是没问题的吧？
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发表于 2011-8-24 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了图解，这里不能贴附件，我放在专业技术版里面了。
cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=33536&h=1&bpg=1&age=0')
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发表于 2011-8-24 13:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
　可否告知你设计80bp引物用来干什麽？做突变么？
eeflying大师说的很有道理，试试吧，请把结果贴出来好么!?!?
　　另外再提醒一次：引物设计时要注意，前60bp也要找二聚体，整个引物进模板找匹配，整个引物找发卡结构，很难的。
　　退火温度也要把握好呀！
　　我们作过的最长的引物只有３０多个（其中１８个匹配），我想你按eeflying的方法效果不好的话，可以试试我的方法（很麻烦的呀＊—＊～～）
      我也做了图解，放在专业技术版里面了。
cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=33536&h=1&bpg=1&age=0')
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兔纸[使用道具]
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发表于 2011-8-24 13:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
no problem. 我的师妹在做Tetremar时,需要在B-微球蛋白的前面加上一个羧化酶的作用位点,25个aa,就是通过合成引物加上的,她的引物比你的还长,结果很好. 并且她的一条引物很长(打开90多个吧,具体记不清了)而另一条只有25个.
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dreaming[使用道具]
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发表于 2011-8-24 13:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢各位大侠指点，我想问一下eeflying，你为什么要设计第二次PCR？第一次的引物完全可以PCR出最后的结果呀。
我的实验是这样的，我想作一种细胞因子的真核表达，但是这种细胞因子本身的信号肽不能有效的促进它的表达，所以我想用其他的信号肽替代这种细胞因子的信号肽，（这段信号肽长度为60bp，）与后面的细胞因子的成熟肽相连，如果将这个信号肽直接连入载体片段太小，不容易连进去，所以我想能不能把它设计成长引物，同时与细胞因子的前面十几个bp一起作为上游引物，下游引物按常规设计，可是这样的话，二者的Tm相差太多，会不会有影响？还有这样扩增是不是会出现非特异性扩增产物？
我想如果把七十几个bp作为上游引物是不是太长了？所以我把它分为了两段，先以细胞因子的成熟肽为模板，以信号肽的后三十个和细胞因子的前13个bp为引物进行一次PCR扩增，然后在以扩增产物为模板，以信号肽的前30bp和模板的前13bp为引物，再进行一次PCR扩增，这样就得到了我想要的片段，我不知道这样可行不可行？
下面是我设计的引物，可是我通过引物设计软件检查总是有发夹结构和二聚体，还有cross dimer是什么意思？我不是太明白，您能不能帮我看一下，我实在不知道该怎么改了。
下面是细胞因子的成熟肽：
     1 AACTGGGTGA ATGTAATAAG TGATTTGAAA AAAATTGAAG ATCTTATTCA
   51 ATCTATGCAT ATTGATGCTA CTTTATATAC GGAAAGTGAT GTTCACCCCA
  101 GTTGCAAAGT AACAGCAATG AAGTGCTTTC TCTTGGAGTT ACAAGTTATT
  151 TCACTTGAGT CCGGAGATGC AAGTATTCAT GATACAGTAG AAAATCTGAT
  201 CATCCTAGCA AACAACAGTT TGTCTTCTAA TGGGAATGTA ACAGAATCTG
  251 GATGCAAAGA ATGTGAGGAA CTGGAGGAAA AAAATATTAA AGAATTTTTG
  301 CAGAGTTTTG TACATATTGT CCAAATGTTC ATCAACACTT CT
下面是我需要的信号肽：
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt
下面是我设计的引物：（P1、P2为上游引物，P3为下游引物）
P1(信号肽后30bp与细胞因子的13个bp)
5' GCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTAACTGGGTGAATG 3'
P2(信号肽前30bp修改后与第一次扩增产物的前13个bp)
5' ATGTATAGGATGCAGCTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTG 3'
P3
5` AGAAGTGTTGATGAACATTTG 3`
还有，如果我加了酶切位点以后，是不是也需要用引物设计软件检查一下？
酶切位点前面的保护碱基有什么要求吗？
希望各位大侠指点！多谢！
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发表于 2011-8-24 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这样呀，其实不必这样做。

１。先把信号肽克隆进载体，70bp应该可做出来，我刚完成一个81bp的细胞因子信号肽构建。
２。测序，确定正确。
３。把细胞因子克隆并插进载体，如果能用T载体倒一下更好。
４。再测序验证。

等于在融合蛋白中间插入了两个氨基酸－－酶切位点。

这样的做法更容易。

对了你信号肽部分为什么不克隆，合成得要多贵呀。

PCR是有突变和错引发的，如果一截一截加的话，理论是可以，但实际中会有另一个问题很讨厌，就是突变，有的时候中
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dreaming[使用道具]
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发表于 2011-8-24 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
３。把细胞因子克隆并插进载体，如果能用T载体倒一下更好。
T载体倒一下是什么意思呀，你是说我先把目的基因先克隆到T载体，测序以后再插入真核表达载体吗？如果我直接克隆到真核表达载体测序行不行呢？

对了你信号肽部分为什么不克隆，合成得要多贵呀。
因为刚开始我觉得60bp太短，没办法直接连到载体中，而且要得到这段信号肽，还要提RNA，进行反转录，我觉得太浪费时间，同时我也不知道什么细胞中高表达这段信号肽。
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wawa[使用道具]
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发表于 2011-8-24 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
把切点加入引物，作完PCR就可以放在T载体了。

因为你的难点在信号肽部分，必须先做信号肽，这样可以同时进行了，
不必等信号肽做完再做下一步，节省时间。

我们这里几乎所有基因都是先放在T载体里，测序后再往后做。
几乎不做PCR后的酶切和连接。

另外RT-PCR可比大引物操作容易多了，大引物操作一个是贵，另一个是突变太多。

如果你连信号肽的来源都没搞明白，是不是做题太草率了？还是先把背景搞明白比较好，这样会省很多钱和时间。
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+田田+[使用道具]
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 小中大
３。把细胞因子克隆并插进载体，如果能用T载体倒一下更好。
T载体倒一下是什么意思呀，你是说我先把目的基因先克隆到T载体，测序以后再插入真核表达载体吗？如果我直接克隆到真核表达载体测序行不行呢？

对了你信号肽部分为什么不克隆，合成得要多贵呀。
因为刚开始我觉得60bp太短，没办法直接连到载体中，而且要得到这段信号肽，还要提RNA，进行反转录，我觉得太浪费时间，同时我也不知道什么细胞中高表达这段信号肽。

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1）T-Vector是最好的保护碱基，从T-vector上切下的片断酶切效率可以认为是百分之百，这是直接切PCR产物做不到的。当然，如果你已经对你加在引物中的保护碱基有把握，直接克隆表达载体也不错。
2）基因合成和克隆是两种获得目的基因序列的不同策略。现在引物并不贵，自己合成小片段很快，很方便。如果要从样品中从提核酸开始扩增基因需要很多的步骤。有时买个试剂盒用不完，反倒多花钱。此外，基因合成允许你对遗传密码进行优化。基因合成策略也是多样的，如果片断小于100bp，我会选择用PCR在基因片段的末端延伸的办法，更快，更有把握，而且不受酶切位点的限制，随心所欲岂不妙哉？是否合成，看你实验室的情况和实验内容权衡吧！达到目的就行了。
3）至于在什么细胞中高表达，要看你后面要做什么工作了。
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