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标题:请问荧光定量(相对定量)比较Ct中如何计算扩增效率

还是孩子[使用道具]
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请问荧光定量(相对定量)比较Ct中如何计算扩增效率

请问荧光定量(相对定量)比较Ct中如何计算扩增效率[转自 丁香园论坛]


我用 Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method Methods. 25, 402, 2001文中的方法,文中关于判定扩增效率一致的方法,就是用斜率的方法我没有看明白,请问哪位高手解释一下?谢谢  
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@木木@[使用道具]
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比较Ct不能计算扩增效率,扩增效率是由斜率决定的
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清风风铃[使用道具]
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我是这样理解的,在扩增效率一致的情况下,相同浓度的内参和目的基因的∆ CT基本上是相同或很接近的,因此梯度稀释的几个点上的差值基本上在一条直线上,因此其斜率很小,接近零。
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菠萝菠萝蜜[使用道具]
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我帮忙翻译一下吧,不对之处还请各位战友指正。该段原文见文章图1下文字。

翻译:
应用ΔΔCT法,目的基因和参照基因的扩增效率必须大体一致。可以用一种灵敏的方法,该方法是通过检测模板梯度稀 释时的CT值变化,来评价两者是否有相同的扩增效率。图1 是cDNA在100倍稀释范围之内的实验结果。每一个稀释梯度的cDNA,c-myc和GAPDH都用特异性的引物和探针检测。由此得到c-myc和GAPDH的平均CT值以及ΔCT (CT,myc- CT,GAPDH)值。cDNA稀释倍数的log值与ΔCT值的曲线图见图1 。如果该曲线的斜率接近0,说明目的基因和参照基因扩增效率是相似的。ΔΔCT法也能够被使用。如图1所示,该曲线的斜率示0.0471,因此斜率接近0的假设成立,ΔΔCT法也可能可以用于分析这些数据。假如两者的效率并不一样,分析就应该通过绝对定量的标准曲线法进行。也可以重新设计引物或优化条件使得两者扩增效率达到相同。

备注:
需要平均CT值,看来每个稀释梯度也是需要同时做几个样本的。
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竹蜻蜓[使用道具]
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我帮忙翻译一下吧,不对之处还请各位战友指正。该段原文见文章图1下文字。

翻译:
应用ΔΔCT法,目的基因和参照基因的扩增效率必须大体一致。可以用一种灵敏的方法,该方法是通过检测模板梯度稀 释时的CT值变化,来评价两者是否有相同的扩增效率。图1 是cDNA在100倍稀释范围之内的实验结果。每一个稀释梯度的cDNA,c-myc和GAPDH都用特异性的引物和探针检测。由此得到c-myc和GAPDH的平均CT值以及ΔCT (CT,myc- CT,GAPDH)值。cDNA稀释倍数的log值与ΔCT值的曲线图见图1 。如果该曲线的斜率接近1,说明目的基因和参照基因扩增效率是相似的。ΔΔCT法也能够被使用。如图1所示,该曲线的斜率示0.0471,因此斜率接近1的假设成立,ΔΔCT法也可能可以用于分析这些数据。假如两者的效率并不一样,分析就应该通过绝对定量的标准曲线法进行。也可以重新设计引物或优化条件使得两者扩增效率达到相同。

备注:
需要平均CT值,看来每个稀释梯度也是需要同时做几个样本的。

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辛苦了,但我想矫正其中的一点笔误,那就是只有当斜率接近0时才能表明几个相关基因的扩增效率基本一致或相似。
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菠萝菠萝蜜[使用道具]
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谢谢,的确是0不是1~
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Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method Methods. 25, 402, 2001

请问原文在哪里啊!  
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麻瓜[使用道具]
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我已经找到了,谢谢,
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饭团团[使用道具]
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我看过这篇文献,但是还是不太明白

我打算用用ΔΔCT法,实验将cDNA稀释成五个稀释度:1、1/4、1/16、1/64、1/256,同时扩增目标基因和内参。数据分析的时候(cDNA稀释倍数的log值与ΔCT值的曲线图),应该以什么作为x轴呢?1、1/4、1/16、1/64、1/256还是1、4、16、64、256的ln值,还是其他??

另外,在excel里作图时,趋势线类型应该选择线性还是对数呢?
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兔纸[使用道具]
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请问一下楼上的各位战友:目的基因和内参基因的扩增效率是否一致是由什么决定的呢:引物设计还是基因片段的本身的性质?如果不一致,可否通过什么方法优化条件使之保持一致呢?
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