小中大荧光定量PCR:从标准曲线的制作到基因表达分析
荧光定量PCR:从标准曲线的制作到基因表达分析[转自 丁香园论坛]
定量PCR定量的基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释的样品作出标准曲线，未知样品和标准曲线相比较从而得到未知样品的量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检测应用中都有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。
标准样品的准备
1、绝对定量。绝对定量就是要确定未知样品的拷贝数。对于这类实验标准品是通过某种方法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列。最常见的是插入有目标序列的质粒，因为质粒是环状DNA有较强的稳定性，而且分子量比较大定量的时候比较准确。也有用线状的PCR产物作为标准品的，通常要比扩增的目标片段要大一些，这也是为了获得分子量比较大的片段，提高拷贝数的准确性。标准品的拷贝数是通过紫外定量的方法来确定，先得到标准品的浓度C(ng/uL)，因为无论是质粒还是PCR产物它们的序列都是已知的，这样通过通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量B，这样标准品的拷贝数A(copy/uL) 为：
A=C/B×6.02E+14
2、相对定量。主要是针对基因表达分析实验而来的，因为要知道都是相对的数值（对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。
实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量，当然在基因表达分析中也不需要，而是要求根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如可以把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和稀释的倍数应该是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。
