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标题:一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

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 小中大

一本待出版的有关PCR技术的新书[转自 丁香园论坛]

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这是一本有关PCR技术的新书，希望会为你的PCR试验提供帮助！
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 小中大
上篇
PCR的基本理论与技术

第一章 聚合酶链式反应
分子克隆(molecular cloning)、DNA测序(DNA sequencing)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是当今现代分子生物学的三大主流技术。在这三种技术中，PCR技术在实践中的应用日益广泛并随着分子生物学实验技术的成熟而不断的创新和拓展。早在二十世纪七十年代初期H.Ghobind Khorana和他的同事就提出了用PCR技术以减少基因的化学合成中的工作量的想法。然而由于当时技术条件的限制，基因测序、引物合成等方面的研究都存在一定的局限性，特别是还没有发现稳定的耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)等诸多因素，使得Khorana的想法在当时看来还不可能实现，并且很快就被人们所遗忘。然而，随着耐热DNA聚合酶的发现，十五年后美国PE.Cetus公司的Kary Mullis和他的同事通过使用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段成功的在体外扩增了哺乳动物的基因(Saiki等，1985；Mullis等，1986；Mullis和Faloona，1987)，从而实现了Khorana的设想，并将这一技术命名为聚合酶链式反应(PCR)。随着从耐热菌Termus aquaticus中提纯的耐热DNA聚合酶的发现和应用(Saiki等，1988)，大大的提高了PCR的效率并推动了其向PCR自动化技术的发展。此后，通过PCR技术，人们能在数小时内通过试管中的反应将特定的DNA片断扩增数百万倍。PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，为医学、遗传学和考古学等学科的研究提供了新的技术手段。目前，与PCR相关的技术已经不断的被开发应用。
第一节 PCR技术的原理
聚合酶链式反应(PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。其反应原理与分子克隆技术的细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。
与细胞内的DNA复制相似，PCR反应也是一个重复地进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。PCR包含下列三步反应：

① 变性(denaturation)：将反应体系混合物加热到95℃，维持较短的时间(大约15~30秒)，使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。
OptionsEmail RepliesDisable J② 退火(annealing)：将反应体系冷却至特定的温度(引物的Tm值左右或以下)，引物与DNA模板的互补区域结合，形成模板?引物复合物。必须精确的计算退火的温度以保证引物只与模板相对应的序列结合。由于模板链分子较引物复杂的多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此DNA模板单链之间互补结合的机会很少。
③ 延伸(elongation)：将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，通过复制单链模板DNA沿5’→3’方向延伸，合成新的DNA链。因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成了新的双链，且双链中的新生DNA单链具有各种不同的延伸长度。
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 小中大
以上三步作为一个循环重复的进行，每一循环的产物作为下一循环的模板。因此，在第二轮循环中通过变性产生的4条DNA单链结合引物并延伸(如图1-1)，在第三轮及更多的循环中重复进行变性、退火、延伸这三步反应。如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。而所有上述过程将在1~2小时内完成。经过扩增后的DNA产物大多为介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片断，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环的不断地进行稀释到可以忽略的程度。
第二节 PCR反应体系
PCR的基本反应体系包括需要扩增的模板(template)、一对寡核苷酸引物(primers)、维持pH值的反应缓冲系统(buffer system)、一价或二价阳离子(monovalent or divalent cations)、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、催化依赖模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶(thermostable DNA)以及PCR促进剂等。
一、 模板(template)
PCR反应的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，先经过逆转录生成cDNA然后再进行PCR反应。PCR反应体系中，对模板的要求如下：
(一) 纯化的模板
DNA模板的来源广泛(可以从纯培养的细胞或微生物中提取，也可以从临床组织标本、犯罪现场标本、病理标本和考古标本中提取)，无论来源如何，待扩增的核酸模板都需要经过纯化处理以除去DNA聚合酶抑制剂。
(二) 模板的形式
含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中。
(三) 线性DNA
由于环状DNA复性太快使其扩增效率略低于线性DNA，故常用线性DNA分子。若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。
(四) 小片段模板DNA
尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格，但是通常小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子。因此，建议在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量。
(五) 适宜的模板量
理论上PCR反应的最佳工作条件需要目标靶序列的单一拷贝作为模板，然而实际工作中常常在反应体系中存在数千拷贝的目标DNA。在哺乳动物基因组，通常每次PCR最多取1µg的基因组DNA作为模板，而这已含有多达3×105常染色体基因的拷贝。而对于简单得多的酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。
二、 引物 (primers)
PCR扩增产物的大小以及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的，因此，引物的选择与序列关系到PCR的特异性。
(一) 引物的质量
一旦确定引物的序列，就可以用核苷酸合成仪合成引物。由于合成的引物中可能含有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整序列和脱嘌呤产物以及可以检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可以导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR反应所用的引物必须是高质量的引物，且需要纯化。通常可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法、离子交换法、高效液相层析法或寡聚核苷酸纯化柱法纯化。然而，使用自动DNA合成仪合成的寡聚核苷酸引物通常可以直接用于标准 PCR而不需要纯化。引物不使用时应在-20℃保存。在-20℃下，冻干引物至少可以保存12~24个月，液体状态则可以保存6个月。
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((二) 引物的设计原则
在影响扩增反应的各种因素中，寡聚核苷酸引物的设计最为重要。为了抑制不需要的序列的扩增而获得大量的预期的产物，我们需要精心的设计引物。
当需要同时扩增靶DNA上的许多片段，即多重PCR(multiplex PCR)时，需要在反应体系中加入一对以上的引物。
PCR反应中有两种引物，即5’端引物和3’端引物。在扩增基因片段或cDNA片段时，通常以信息链为基准，5’端引物与位于待增片段5’端上游的一小段DNA序列相同，引导信息链的合成；3’端引物与位于待增片段3’端的一小段序列互补，引导互补链的合成，PCR反应的扩增产物就是这一对引物之间的双链DNA片段。
不同的PCR反应体系，由于模板的组成、待增片段的长度及其使用目的的不同，对引物的要求也不相同。引物设计的基本原则是最大限度的提高扩增效率和特异性，同时尽可能地抑制非特异扩增。引物设计的基本要求如下：
1. 引物的长度：设计引物的目的是要提高PCR的特异性。因此，这就要求引物与模板DNA中的靶序列以较稳定的形式互补结合。寡聚核苷酸的长度越长，获得的特定靶序列的特异性就越好，引物过短则会影响PCR的特异性。然而，引物过长会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度，也会影响产物的特异性。因此，引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。
2. 基本成分：G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。
3．引物自身：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。
4. 引物之间：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。
5. 3’末端：引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对。四种碱基引起的错配有一定的规律，以引物3’端A的影响最大；另外，引物3’末端碱基错配时，不同碱基的引发率存在很大差异，当末位碱基为A时，错配的引发率大大降低，而当末位碱基为T时，错配的情况下也能引发链的合成。因此，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。
6. 5’末端：引物的5’端并无严格的限制，在与模板结合的引物的长度足够的前提下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而成游离状态。通常这些序列对寡聚核苷酸引物与模板的结合的影响并不显著。因此，引物的5’端可以被修饰，如附加限制酶酶切位点、引入突变位点、标记生物素、荧光物质、地高辛等，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。在后续的扩增循环中，这些与模板未配对的序列将被带到PCR产物的双链中，故在其PCR产物中，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。

[ 本帖最后由 荷塘青蛙！ 于 2011-8-24 16:18 编辑 ]
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7. 溶解温度：3’端引物和5’端引物应有相似的Tm值，其差别不应大于5℃。扩增产物与引物的Tm值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有效的变性。
8. 引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。
9．引物的简并性：引物的3’端应为保守的氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。
引物的设计要考虑多方面的综合因素，依据实际情况具体分析，应尽量遵循上述原则。现在有许多设计引物的计算机软件，能综合分析优化组合引物的各种参数，对引物设计具有指导作用。
(三) 引物的用量及其计算
在PCR反应体系中，引物的浓度一般要求在0.1~0.5µM之间，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。引物浓度过低，则产物量低；引物浓度过高则会促进引物二聚体的形成以及非特异性产物的形成。非特异性产物和引物二聚体都可以作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物，从而抑制靶序列的扩增。
引物浓度的计算可按下面的方法进行：摩尔猝灭系数(EM)是1cm光程比色杯中测定1mol/L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度(OD)值。EM可按下式计算：
EM=a(16000)+b(12000)+c(7000)+d(9600)
其中，a、b、c和d分别代表寡核苷酸引物中的A、G、C和T的个数。
例如：一纯化的24bp寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10μl稀释至1ml，测其OD=0.76，原液OD为0.76×100=76，若此寡核苷酸的碱基组成为A=G=C=T=6，其EM=6×16000+6×12000+6×7000＋6×9600=267600，故原液中的寡核苷酸浓度为76÷267600=3.4×10-4mol/L=340nmol/L。
三、 反应缓冲系统(reaction buffer system)
反应缓冲系统提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl (pH8.3~8.8，20℃)，在72℃(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于6.8~7.8之间。
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反应缓冲系统中还含有KCl，50mM以内的KCl有利于引物的退火，而50mM以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。然而，也有人认为含有50mM KCl的缓冲系统有利于大于500bp的DNA片段的扩增，然而将缓冲系统中的KCl浓度提高到70~100mM则有利于提高较小的DNA片段的扩增产量。
此外还可以向反应缓冲系统中加入Taq酶保护剂，如小牛血清白蛋白(100µg/ml)、明胶(0.01%)、Tween-20(0.05%~0.1%)或二硫基苏糖醇(DTT，5mmol/L)等。
四、 二价阳离子(divalent)——Mg2+
所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子(通常是Mg2+)。虽然使用含有Mn2+的缓冲溶液也可以使一些聚合酶具有催化活性，但其效率要比加入Mg2+低得多；而Ca2+则不能活化DNA聚合酶。因此，PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体系中游离Mg2+浓度直接相关。反应体系中Mg2+浓度低时，酶的活力显著降低；过高时，酶则催化非特异性扩增。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。值得注意的是，由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度，因此Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2~2.5mmol/L。如果可能的话，制备DNA模板时尽量不要引入大剂量的螯合剂(如EDTA)或负离子(如PO43-)，因为它们会影响Mg2+的浓度。
五、 三磷酸脱氧核苷酸(deoxynucleotide triphosphates,dNTPs)
四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为PCR反应的合成原料。在标准的PCR反应中各种dNTP的浓度应相等，若任何一种浓度明显不同于其它几种时，会诱发聚合酶的错误掺入从而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响到PCR反应的速度和特异性，因此应严格的控制PCR反应体系中dNTP的浓度，具体要求详见第四节。
许多厂商出售专门用于PCR的dNTP储存液。这种储存液具有较强的酸性而不含焦磷酸盐，其目的是保护dNTP在储存液的冷冻和加热期间受到破坏。因此在使用前应用NaOH将pH值调至7.0~7.5。无论是自配的还是购买的dNTPs溶液在储存前都应分成较小的几份，然后在-20℃下储存，经过两次冷冻-加热循环后储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存，储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上，因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。
六、 耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)
1983年美国PE Cetus公司的Kary Mullis使用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段首先建立了PCR技术，其延伸温度为37℃，然而由于Klenow片段在95℃的DNA变性温度下完全失活，因此在每轮循环步骤之后都需要再添新酶，操作十分繁琐，并导致反应体系中形成快速沉积变性的酶蛋白。此外，由于Klenow片段聚合反应温度偏低，引物与模板的非特异性结合增加，导致非特异性产物增多；同时，由于受到某些DNA二级结构的影响，聚合反应不完全，得不到完整的PCR扩增产物。直到1987年，发现了热稳定的Taq DNA聚合酶(Taq pol)等耐热的DNA聚合酶后，才使PCR技术有了重大的发展并逐步实现了自动化。
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耐热DNA聚合酶能经受95℃以上的高温而不失活，因而无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应的最适温度为70~80℃，此时引物与模板结合的特异性好，故产物的纯度高。现在已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性，但各耐热DNA聚合酶的性能尚有一定的差别。目前在PCR反应中应用最多的是Taq pol。
(一) Taq DNA聚合酶
天然的Taq pol是从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1菌株中分离获得的。该菌株在1969年就从美国黄石国家公园的温泉中分离出来，能在70~75℃生长。现已克隆出该酶的基因，全长2499个碱基，编码分子量为94kD、长度为832个氨基酸的蛋白质。现将Taq pol的特点叙述如下：
1. 高热稳定性：Taq pol在92.5℃、95℃、97.5℃的半衰期分别为130min、40min和5~6min。在PCR反应中DNA变性时间通常为30~60s，若总共进行30轮循环累计热变性时间为15~30min，此时该酶仍然保持相当高的活性，完全可以保证PCR反应的需要。
2. 高催化活性：在已发现的耐热DNA聚合酶中，Taq pol的活性最高，达200,000U/mg。实验证明Taq pol的活性有明显的温度依赖性，Taq pol催化DNA合成的最适温度为75-80℃，此时延伸速率达150~300个核苷酸/秒/酶分子；70℃时为60个核苷酸/秒/酶分子；55℃时为22个核苷酸/秒/酶分子；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒/酶分子。当温度超过80℃时，几乎没有DNA的合成，可能与高温下引物和模板结合的稳定性遭到破坏有关。
3. 忠实性：序列分析表明Taq pol与Ecoli pol I N端区域(此区域与该酶具有5’→3’外切酶活性有关)高度同源，因此Taq pol亦有5’→3’端的外切酶活性。然而由于Taq pol没有E coli pol I的3’→5’外切酶活性区的同源序列，故Taq pol无3’→5’外切酶活性。因此，Taq pol不具有Klenow酶的校对功能，在其催化的PCR扩增过程中引起碱基错配的机率大大增加。通常，Taq pol在PCR反应出现碱基错配的机率为1/300~1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中每400个碱基就有一个与原始序列不同。
4. 逆转录活性： Mg2+在2~3mmol/L的浓度下，68℃时使该酶出现类似逆转录酶的活性。若有Mn2+存在时，其逆转录活性更佳。有报道，若反应体系中没有Mn2+，则不能进行150~250个核苷酸以上核酸的逆转录反应。利用这一特性，可以直接用于RT-PCR，尤其是短片段的扩增。
5. 非模板依赖的聚合活性：Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的活性，可在新合成的双链产物的3’端加上一个非模板依赖的碱基。在四种dNTP中，该酶对dATP的聚合能力最高。所以，在标准PCR反应条件下，PCR产物的3’端的非模板依赖的碱基几乎总是A。利用这一特性，我们可以构建dT-载体来克隆带dA尾的产物。用Klenow酶可以将3’端的非模板依赖的聚合碱基去掉，即在PCR反应后，先加热至99℃10min灭活Taq pol，然后调整Mg2+浓度至5~10mmol/L，加入1~2U大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段，室温下作用15~20min。
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耐热DNA聚合酶能经受95℃以上的高温而不失活，因而无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应的最适温度为70~80℃，此时引物与模板结合的特异性好，故产物的纯度高。现在已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性，但各耐热DNA聚合酶的性能尚有一定的差别。目前在PCR反应中应用最多的是Taq pol。
(一) Taq DNA聚合酶
天然的Taq pol是从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1菌株中分离获得的。该菌株在1969年就从美国黄石国家公园的温泉中分离出来，能在70~75℃生长。现已克隆出该酶的基因，全长2499个碱基，编码分子量为94kD、长度为832个氨基酸的蛋白质。现将Taq pol的特点叙述如下：
1. 高热稳定性：Taq pol在92.5℃、95℃、97.5℃的半衰期分别为130min、40min和5~6min。在PCR反应中DNA变性时间通常为30~60s，若总共进行30轮循环累计热变性时间为15~30min，此时该酶仍然保持相当高的活性，完全可以保证PCR反应的需要。
2. 高催化活性：在已发现的耐热DNA聚合酶中，Taq pol的活性最高，达200,000U/mg。实验证明Taq pol的活性有明显的温度依赖性，Taq pol催化DNA合成的最适温度为75-80℃，此时延伸速率达150~300个核苷酸/秒/酶分子；70℃时为60个核苷酸/秒/酶分子；55℃时为22个核苷酸/秒/酶分子；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒/酶分子。当温度超过80℃时，几乎没有DNA的合成，可能与高温下引物和模板结合的稳定性遭到破坏有关。
3. 忠实性：序列分析表明Taq pol与Ecoli pol I N端区域(此区域与该酶具有5’→3’外切酶活性有关)高度同源，因此Taq pol亦有5’→3’端的外切酶活性。然而由于Taq pol没有E coli pol I的3’→5’外切酶活性区的同源序列，故Taq pol无3’→5’外切酶活性。因此，Taq pol不具有Klenow酶的校对功能，在其催化的PCR扩增过程中引起碱基错配的机率大大增加。通常，Taq pol在PCR反应出现碱基错配的机率为1/300~1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中每400个碱基就有一个与原始序列不同。
4. 逆转录活性： Mg2+在2~3mmol/L的浓度下，68℃时使该酶出现类似逆转录酶的活性。若有Mn2+存在时，其逆转录活性更佳。有报道，若反应体系中没有Mn2+，则不能进行150~250个核苷酸以上核酸的逆转录反应。利用这一特性，可以直接用于RT-PCR，尤其是短片段的扩增。
5. 非模板依赖的聚合活性：Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的活性，可在新合成的双链产物的3’端加上一个非模板依赖的碱基。在四种dNTP中，该酶对dATP的聚合能力最高。所以，在标准PCR反应条件下，PCR产物的3’端的非模板依赖的碱基几乎总是A。利用这一特性，我们可以构建dT-载体来克隆带dA尾的产物。用Klenow酶可以将3’端的非模板依赖的聚合碱基去掉，即在PCR反应后，先加热至99℃10min灭活Taq pol，然后调整Mg2+浓度至5~10mmol/L，加入1~2U大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段，室温下作用15~20min。
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(二) 其它耐热DNA聚合酶
目前已经发现了多种耐热DNA聚合酶，并对它们的特性进行了研究，同时人们还致力于对现有的耐热DNA聚合酶的修饰改造，以获得更好的性能，从而提高PCR的产量和质量。目前，主要有从嗜热栖热菌(T. thermophilus)中分离的Th DNA聚合酶、从litoralis栖热球菌(T. litoralis)中分离的Vent DNA聚合酶、从酶热硫化裂片菌中分离出的Sac DNA聚合酶以及修饰Taq DNA聚合酶等。现将其特点分述如下：
1. 修饰Taq DNA聚合酶：常见的有重组Taq pol(rTaq pol.)和Stoffel片段。重组Taq pol为Letus公司利用基因工程在大肠杆菌中表达的Taq pol，其热稳定性比天然Taq pol要好，97.5℃时的半衰期达10min，此外Taq pol的热稳定性还与KCl的浓度有关，KCl的浓度分别为50mmol/L、25 mmol/L和10 mmol/L时，97.5℃保温10min后，Taq pol的活性分别下降50%、70%和80%。Stoffel等人首先通过除去Taq pol N端的289个核苷酸得到一种无5’→3’外切酶活性的61000的酶蛋白，故将其称为Stoffel片段。Stoffel片段的热稳定性极佳，97.5℃的半衰期达到了20min，比Taq pol延长了两倍多，利用此酶可以提高PCR反应中的变性温度，这对于扩增GC丰富的模板及具有二级结构的模板极为有利。同时由于Stoffel片段的Mg2+浓度作用范围增大为2~10mmol/L，故运用Stoffel片段可以改善复合PCR的反应结果。
2. Th DNA聚合酶：该酶从嗜热栖热菌(T. thermophilus)中分离得到，在高温和MnCl2存在的条件下，能有效的转录RNA。当螯合了Mn2+后再加入Mg2+，则可以使该酶的聚合活性增加，因此cDNA的合成与扩增可以用同一种酶催化。此外该酶对抑制Taq pol的血液成份的耐受力较强。
3. Vent DNA聚合酶：New England Biolabs公司从海底火山口 98℃水中生长的Litoralis栖热球菌中分离提纯得到Vent DNA聚合酶，并在大肠杆菌中成功的表达了该酶。此酶的热稳定性极好，97.5℃下的半衰期长达130min。此外Vent DNA聚合酶还具有3’→5’外切酶的活性，因此在催化DNA合成时具有校正功能，从而有效的降低碱基错误掺入率，提高扩增的忠实性。其碱基错误掺入率为1/31000，扩增产物的忠实性比Taq pol提高5~10倍。
4. Sac DNA聚合酶：该酶是从酶热硫化裂片菌中分离纯化得到的，其Mg2+的浓度作用范围较大，为2~8mmol/L，故有利于复合PCR反应的进行。此外，Sac DNA聚合酶也可用于DNA测序，但测序中ddNTP/dNTP的比率要高。此外，该酶还可以用于基因的定点融合等。
5. Pfu DNA聚合酶：Pfu DNA聚合酶是从Pyrococcus furisus菌体中提纯的，该酶具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切酶活性，故此酶具有校正功能，其催化DNA合成的忠实性要比Taq pol高12倍。此外，Pfu DNA聚合酶的耐热性极好，97.5℃的半衰期大于3小时。由于在无dNTP存在时Pfu DNA聚合酶会降解模板DNA，故在反应时此酶一定要最后加到反应体系中。然而，由于该酶采用低盐缓冲溶液(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2，10 mmol/L KCl，6mmol/L (NH4)2SO4，1.5mmol/L MgCl2，0.1% Triton x-100，10ng/ul BSA)，故退火温度较低，在37℃~45℃之间。
我国的PCR技术发展和应用十分迅速，现在复旦大学、中国医科院、华美公司均能生产耐热DNA聚合酶，耐热DNA聚合酶的国产化对推动我国PCR技术的发展、普及起着极其积极的作用。
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发表于 2011-8-24 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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七、 PCR促进剂
据报道通过向PCR反应体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。助溶剂包括甲酰胺(formamide)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和甘油(glycerol)；添加剂包括氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride，TMAC)、谷氨酸钾(potassium glutamate)、硫酸铵(ammonium sulfate)、离子化及非离子化的除垢剂等。目前关于PCR反应促进剂对扩增效率的影响机制尚不清楚，可能是添加剂消除了引物和模板的二级结构，降低了DNA的解链温度使双链DNA变性完全。同时PCR反应促进剂还增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。下面介绍一下几种常见的PCR促进剂：
(一) DMSO
反应体系中加入5~10%的DMSO有利于DNA的变性。使用DMSO对大肠杆菌的DNA聚合酶的Klenow片段是有益的，但是对Taq DNA聚合酶具有抑制作用。
(二) 甘油
反应体系中加入5%~20%的甘油有利于DNA的复性，尤其是对富含G+C的二级结构以及长片段的靶序列的扩增更适用，但需要注意甘油并非对所有的PCR都有益。
(三) TMAC
在反应体系中加入1×10-4~1×10-5mol/L的TMAC可以去除非特异扩增，不抑制Taq DNA聚合酶活性，促进PCR。
大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR反应起抑制作用，故在实验中应根据具体的情况选用适当浓度的PCR促进剂。
第三节 PCR的反应温度和循环参数
PCR反应是一个重复的循环过程，每一循环包括三个阶段的反应，加热而导致模板的变性，变性后寡聚核苷酸引物和与它互补的单链靶序列杂交而退火以及由热稳定DNA聚合酶的介导使已杂交的引物的延伸。
一、 变性温度与时间
在PCR反应中，能否成功的使模板DNA和PCR产物变性是反应成败的关键。只有当模板DNA和PCR反应产物完全变性成为单链后，引物才能在退火过程中与模板结合。变性通过加热来实现。变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。
二、 退火的温度与时间
退火的温度决定着PCR反应的特异性。引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。引物长度越短、G+C的比率越低，所需的退火温度就越低。一般来说，降低退火温度可提高扩增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高退火温度可减少引物与模板间的非特异性结合从而提高反应的特异性，但扩增效率下降。退火温度确定后，退火的时间并不是关键性的因素，但也应加以控制。退火时间过短，会导致延伸失败；而退火时间太长会增加引物与模板间的非特异性结合。
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