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标题:【求助】全血基因组DNA提取问题

bgf5[使用道具]
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【求助】全血基因组DNA提取问题


我用的是上海生工的血液基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱型)的,可是我提完之后跑电泳,看不到任何带子。我其中的问题可能是:
1)说明书---在500μl血液中加入800μl的TBP Buffer用1ml的Tip 头轻轻吹打使其彻底混匀,而后4,000转/分离心3分钟,弃上清。
本人做实验----离心转数8000转/分;弃上清时,我没有用枪头吸出,而是轻轻将上清液倒出,只留下管底一点点无色透明的沉淀,特别少。这样对吗?是不是上清去除的太多了?也不应该直接倒?我发现用枪头吸的话有时会吸到最底层的沉淀。
2)说明书---在准备好的200μl样品中加入500μl TBM Buffer,混匀;再加入4μl Proteinase K,混匀,55℃保温10~20分钟。
本人做实验---保温30-40分钟。因为我的血标本时间最长的可到14个月。是不是保温时间太长了?
3)我跑电泳的琼脂糖胶浓度为1%,我加的电压是250V,时间是20分钟。紫外灯下观察,什么也没有。
其他步骤完全是按照试剂盒说明书进行的。我已经连续做了6个,都不行!心里很难过。我们实验室的分光光度计不能用。现在放假,别的科室也没有人。我真是...
大家看看我到底是哪一步出问题了?还有,今天我怕是我采的血时间太长,DNA降解了,我直接抽自己的新鲜血提的DNA,还是不可以。实验室就我自己,我急的都哭了!明年就毕业了,可是连个DNA都提不出来,PCR更是别说!
更附:DNA提取试剂盒说明书,我实在找不出我失败的原因。
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建议你不用生工的试剂盒,我们碰到过类似的问题,生工的人说是离心柱的问题。你可以买更好的试剂盒或用手提(加蛋白酶、RNA酶)
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bgf5[使用道具]
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你好,我买生工的试剂盒还是别人介绍的。我原来买的赛百盛的,更是不行。你知道哪个公司的试剂盒比较好吗?还有,增加消化时间会不会好一些呢?是不是基因组DNA释放,不仅要破坏细胞膜又要破坏核膜,比较不容易呢?真是愁煞我了!
你说的用手提是什么意思,是用酚-氯仿的方法吗?我的邮箱是zhaomeixing@yahoo.com.cn。可以多介绍介绍吗?万分感谢!
别人都说DNA特别好提,而且我看了大家的提问,没有几个人问提DNA的问题,是不是我太笨了啊?哎...
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建议您用碘化钾的方法提取外周血DNA,这个方法简便、快速、经济,我实验了几次,结果比较理想。
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QUOTE:
原帖由 bgf5 于 2015-8-1 17:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好,我买生工的试剂盒还是别人介绍的。我原来买的赛百盛的,更是不行。你知道哪个公司的试剂盒比较好吗?还有,增加消化时间会不会好一些呢?是不是基因组DNA释放,不仅要破坏细胞膜又要破坏核膜,比较不容易呢?真是愁煞我了!
你说 ...

适当增加消化时间确实利远大于弊,我们经常消化半小时到两三个小时,因为前面的溶液里面有EDTA,所以基本不用担心DNA降解,放心消化。
另外,我也不推荐生工的试剂盒,但也相信他们的试剂盒会到这种程度,可能是样品本身或者操作有什么问题。
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看到你真是高兴,刚才我在核酸技术版就得到你的答复了,我今天又提了两个,增加了消化时间(由原来的30分钟提到2个小时),我觉得效果好了很多。而且我新配制了电泳液和琼脂糖凝胶,带子跑的很好。
我想问你另一个问题:我提出DNA来,做PCR,然后酶切,我用的限制性内切酶是RsaⅠ和HindⅢ,这两种都是比较常见的酶,我买的是赛百盛的,可以吗?原来是想买生工的,可是看了大家说生工的酶不好,吓的我不敢买了。呵呵,我这回没有买错吧?
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一些大品牌进口的试剂盒说明书,通常把时间、产量等数据写的比较保守,而国产试剂盒喜欢写上他们做出来过的“最优”数据,来显示试剂盒性能多么的好。比如说半个小时就能提完****,反应5min就能****,实际上那些说半个小时就能提完DNA的,通常三步水浴时间加起来就是半个小时,除非别的操作不占用时间,那些反应5min的,经常是各种条件都是最合适的时候做出来的。
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你说的可真对啊,我是自己做过才知道国产的是怎么样吹的,可真是害人啊!哎。。。白浪费我的眼泪了!
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我最近又连续做了30多个,跑胶总是15个出8个,11个出6个,而且荧光特别弱,在普通紫外灯下根本看不到,在凝胶成像仪上也是特别弱。怎么会这样呢?难道非要我换试剂盒啊?苦!
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换个试剂盒吧
QIAGEN 的不错啊
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