大家加完PCR体系后有没有用仪器振荡混匀呢？

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标题:大家加完PCR体系后有没有用仪器振荡混匀呢？

冷眼相对[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问，大家加完PCR体系后有没有用仪器振荡混匀呢？ [转自丁香园论坛]

我每次加完PCR体系后，没有混匀，直接离心就拿去做PCR了。

第一次扩增出来了，条带很清晰。

后来一直不出来。

前几天又出来了一次，条带很清晰。

再后来又不出来了

可不可能是因为PCR体系没有混匀的缘故呢？大家加完PCR体系后，都会用仪器混匀么？

请各位高手指点。谢谢！

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

离心即可，不用混匀！

free[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

手指弹拨混匀。然后离心。

海鸥crazy[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加完PCR体系后，不需要混匀和离心，直接可以拿去做PCR了。

理由是任何PCR反应多有94——95度，5mins这一步，由于是液体环境，在这几分钟中任何东东都应该混合很均匀了。

混匀和离心都是很可笑的，我当年这么做，把老外看的发呆。

想想当初也太业余了。

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 海鸥crazy 于 2011-8-30 15:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
加完PCR体系后，不需要混匀和离心，直接可以拿去做PCR了。

理由是任何PCR反应多有94——95度，5mins这一步，由于是液体环境，在这几分钟中任何东东都应该混合很均匀了。

混匀和离心都是很可笑的，我当年这么做，把老外看的发呆。 ...

同意你的观点，但是，如果你把最后把模板或者引物加到管壁上，还是要稍离心的!

格格巫[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

离心即可，不用旋涡器混匀，因为你加的每一样都是微量的，常在加样过程中沾在微量离心管壁上，所以最好离心一下

冷眼相对[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哦

谢谢大家。

我的PCR时而出来时而不出来，现在老是不出来，找了好久的原因，好不容易找到这个理由，看来又不是的呢。：（

请大家继续帮我分析一下，究竟可能是什么原因导致的呢？

冷眼相对[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小米虫子[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 冷眼相对 于 2011-8-30 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
哦

谢谢大家。

我的PCR时而出来时而不出来，现在老是不出来，找了好久的原因，好不容易找到这个理由，看来又不是的呢。：（

请大家继续帮我分析一下，究竟可能是什么原因导致的呢？ ...

1.酶的问题
2.ddH2O的Ph变化
3.镁离子浓度变化

你可以用Taq PCR MasterMix (Cat#KT201) 天为时代出品，省时省力，简单，容易成功

Darcy[使用道具]
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发表于 2011-8-30 15:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以这样做：
1、重新用引物母液稀释成工作引物（原因：工作引物的多次冻溶会使引物降解,至少会大大减少其有效成分）
2、换成新的PCR试剂（包括：模板、酶、BUFFER、镁离子、灭菌DDH2O等，原因：同样，PCR试剂的多次冻溶，也会使试剂失效）
3、使用不同的镁离子浓度和不同的温度梯度摸索最佳反应条件。

Good luck! You can do it!

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