PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】退火温度该怎么确定

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】退火温度该怎么确定

bs4665[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75127
精华 0
积分 505
帖子 650
信誉分 100
可用分 4136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
1

发表于 2015-8-3 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】退火温度该怎么确定


最近做PCR试验以Tm-5值作为退火温度总是扩不出来带，而使用Tm作为退火温度却得到一些带，请帮忙分析一下为什么。谢谢！
顶部
ha111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72969
精华 0
积分 821
帖子 1239
信誉分 101
可用分 7048
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
2

发表于 2015-8-3 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚开始做PCR时也遇到楼主遇到的问题，发现不能按书上的推算，还是以实际实验为准。我现在一般先用TouchdownPCR摸索Mg离子浓度和引物浓度能条件，然后在用温度梯度PCR确定退火温度。发现我的大部分引物退火温度一般都在Tm值左右或者还好。
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
3

发表于 2015-8-3 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

按书上写，退火温度应为tm值-5度左右，但是实际情况不尽其然，我的经验是除了退火温度之外，还有镁离子浓度。按你所说，以tm为退火温度有杂带，还应调整镁离子浓度试试，退火温度本身可能差不多了。而且引物设计是否合理？从源头把关啊！
顶部
ldh[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117813
精华 0
积分 276
帖子 291
信誉分 100
可用分 2196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
4

发表于 2015-8-3 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Tm值件10度做退火温度进行PCR吧
顶部
莲花白[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74499
精华 1
积分 286
帖子 247
信誉分 102
可用分 2016
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
5

发表于 2015-8-3 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接从55度退火，要是有杂带，就升高退火温度，如果没有产物就降低退火温度，然后还要结合镁离子浓度调整。
顶部
dior[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72222
精华 1
积分 582
帖子 819
信誉分 102
可用分 4906
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
6

发表于 2015-8-3 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

试试降落PCR，退火可以从高Tm值3-5度降到底10度，然后在最后的一个温度上稳定循环20个左右，不需要摸索退火的条件，最好再用好点的酶，高保真的酶
顶部
eor[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117906
精华 0
积分 392
帖子 484
信誉分 100
可用分 3226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
7

发表于 2015-8-3 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
直接从55度退火，要是有杂带，就升高退火温度，如果没有产物就降低退火温度，然后还要结合镁离子浓度调整。

===============================================================================================================

我原来也是一开始用55度，结果什么也没有，降低退火温度，也什么也没有，后来做温度梯度，发觉退火温度在60度以上。（我的Tm为58度）分析原因，发现退火温度低，非特异性扩增太厉害，就根本不出现条带，而是糊成一片，哪怕是有那么几条。
顶部
3.14[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117870
精华 0
积分 275
帖子 290
信誉分 100
可用分 2171
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
8

发表于 2015-8-3 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教：
如何用TouchdownPCR摸索Mg离子浓度和引物浓度能条件？
顶部
eor[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117906
精华 0
积分 392
帖子 484
信誉分 100
可用分 3226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
9

发表于 2015-8-3 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一般这样设计TouchdownPCR程序，第一个循环退火温度从比Tm值高3度，然后每个循环退火温度降低0.5度，直降到比Tm小10度（每个温度都只扩增一个循环）。
顶部
finger[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71816
精华 0
积分 574
帖子 787
信誉分 100
可用分 4799
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
10

发表于 2015-8-3 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般57度，58度都会出结果。可以从50度开始升温，做完一次，升2度降一度，如此往复。Tm值只是理论上的估测，实际还应摸索。
顶部