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标题:【求助】提RNA过程影响纯度和质量的关键是否...

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发表于 2015-8-3 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】提RNA过程影响纯度和质量的关键是否...

用TRIZOL作用20分钟后,转裂解液入EP管,加入1/5体积氯仿, 剧烈振摇30秒,静置15分钟后,准备上离心机12,000 RPM之前,观察各EP管TRIZOL与氯仿分层情况, 发现很多管TRIZOL 与氯仿分层都不明显; 而只有1管分层明显; 提RNA结果分层不明显的管RNA比值都在1.3左右,而分层明显的管比值在2.0.这个对比说明什么问题呢?操作有什么技巧吗?提RNA的得率和纯度总是不稳定,有时高,有时低,而我们科室有个师姐每次提的比值都在1.9-2.0左右,原来看她提过一次,但也分析不出和用TRIZOL作用20分钟后,转裂解液入EP管,加入1/5体积氯仿, 剧烈振摇30秒,静置15分钟后,发现很多管TRIZOL 与氯仿分层都不明显; 而只有1管分层明显; 提RNA结果分层不明显的管RNA比值都在1.3左右,而分层明显的管比值在2.0.这个对比说明什么问题呢?操作有什么技巧吗?提RNA的得率和纯度总是不稳定,有时高,有时低,而我们科室有个师姐每次提的比值都在1.9-2.0左右,原来看她提过一次,但也分析不出和我的步骤有什么关键差别,现在我想,是不是差别主要在前边这几步呢?因为蛋白只会在TRIZOL和氯仿这两步除去,如果这两步效果差,那最后肯定有很多蛋白掺杂,导致纯度低.大家都是怎么做的呢?请讨论一下吧.
我的分析:
1 TRIZOL去蛋白水平不行; 可是以前还好啊,TRIZOL是前三个月前订的,应该不会失效这么快.
2 TRIZOL未充分裂解,加入TRIZOL后我就用枪吹打数次, 然后间断振荡, 不知大家怎么做的?到底该怎么让其充分裂解呢? 要是提组织RNA呢?怎么让TRIZOL充分裂解组织呢?
3 氯仿去蛋白水平不行; 可是以前还好啊,氯仿作为萃取溶剂,应该不存在污染失效的问题吧.
4 氯仿未充分与裂解液作用, 可是我剧烈振摇30秒,应该可以了吧?
5 加入氯仿静置时间短,导致分层不明显:同样10管,我都放了15分钟,有一管分层明显,就能够说明时间够了;
6 加入的组织过多?导致TRIZOL不能完全消化?我一般加入的组织是黄豆大小,加1毫升TRIZOL裂解,研磨消化完全后,加入氯仿,这样应该不会有问题呀?
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发表于 2015-8-3 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么不离心呢？12000转 15分钟！RNA的提取涉及到每一步，应该按照规程做才能保证结果有效。
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发表于 2015-8-3 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

离啊,我的意思是说,氯仿离心之前观察一下分层情况,可能有助于判断RNA纯度;
可能没表达清楚,再改过了,请大家看看
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发表于 2015-8-3 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也不是很清楚是否在离心前观察分层的情况意义很大
不过的确存在有时侯 提的好,有时后提的差,个人认为和组织或是细胞的量关系挺大的
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发表于 2015-8-3 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

纯度与组织或是细胞的量确实相关,不过前提是TRIZOL加的量少;

如果加与组织或细胞相适应的TRIZOL量就可以充分裂解,去除蛋白了
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发表于 2015-8-3 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也碰到这个情况，以前提得都挺好，加氯仿振摇，离心前看到明显分层，但后来做的都无明显分层，离心后上清也少，仔细回想分析也不知是何缘故。
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qianqin1977[使用道具]
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 小中大

我也遇到类似问题，无明显分层，或离心后上清很少，会影响RNA提取结果吗？我也认为与细胞数量有关系。
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发表于 2015-8-3 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你提取的是细胞的还是组织的RNA吗？
如果是细胞我们的做法一般是加入1ml TRIZOL到EP管后，振荡，然后再冰上放置15－20分钟左右，后面就加0.2ml的氯仿，振荡器上剧烈振荡30秒，室温放置2、3min，再冰上放置20分钟，一般都可见到分层的，然后12000 离心20min，取上清，加等体积异丙醇-20度过夜，然后再12000 离心20min，去上清，加预冷的75％乙醇吹打漂洗，7500 离心10min，再去上清，晾干至半透明，加无RNA酶的水溶解。
如果是组织的，我们一般是取100mg的组织，加入1ml TRIZOL到匀浆管中，充分匀浆（冰上）至肉眼看比较均匀为止，大约1-2分钟吧，然后室温放置2、3分钟后，再加0.2氯仿，振荡，后续步骤就是一样的了。
每次做我们都可以看到明显的分层，如果是组织的，我们做的比较多些，第一次离心后一般可以取到500－600ul的上清的。我们实验室一直是这样做的，比值基本都在1.8-2.0左右。
我觉得TRIZOL和氯仿失效的可能性不大，由于我们的实验经费有限，有时我们用的都是师兄师姐剩下的没用完的TRIZOL，买来都有1年多的时间呢，一直在4度放着的，我做过提出的RNA也没有问题。
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发表于 2015-8-3 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在提取外周血单个核细胞RNA的时候也是出现RNA纯度不高且不稳定的情况，我用的是国产的Trizol，同样加1ml，加样器吹打1分钟（每次都吹得我手痛！），转移至Ep管，室温放20分钟，加氯仿200ul，剧烈振摇1分钟，冰上放置15分钟，每管均可见分层，故个人认为吹打是否充分和放置时间对RNA提取有影响；离心后可得上清600ul左右；再经异丙醇和75%乙醇处理后，1%琼脂糖电泳可见清晰28s和18s带，但RNA比率经常在1.3-1.6左右，我也为此苦恼，且下面的RT过程进行的并不顺利，连内参也扩的很淡，有大虾可否告我，我提的RNA有蛋白污染的话，对RT过程是否有影响？国产的Trizol是否提取效果不好？
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发表于 2015-8-3 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的经验是，从组织中用TRIZOL提RNA时组织的量并不是越多越好，在一定范围内是正好相反。我曾经做过对比，同一块组织经匀浆后做一定稀释，分别取50、100、150、200ul匀浆液提RNA做反转录PCR，除了组织的量不同外其它条件都一致，结果只有50ul的样品扩出了所需要的目的片段，经克隆测序验证正确。
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