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标题:求教高手指点~

mogu[使用道具]
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发表于 2011-8-30 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求教高手指点~

求教高手指点[转自 丁香园论坛]


各位大侠，本人特来求助啊，希望能尽快得到答案，解决问题，已经被老板催的没魂了。问题如下：
我的PCR目的是鉴定转基因阳性植株，我先用抗性标记基因nptII扩增，100个样品有90个是可以得到目标条带的，但是扩增目标基因就是死活都扩不出来，而这其中有几个样品是我以前用目标基因成功鉴定了的，而且做了四次重复，每次都有目标带，而这一次也不行了。然后我觉得是不是以前鉴定过的那些模板降解了？然后我又去采了以前鉴定过的那批样，从新提DNA，还是可以扩增出来筛选标记基因，但是就是无法得到目标片段。当然，扩增循环参数是一直没变的。
烦请各位高人指点啊，帮着出出主意！谢谢大家了
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大猫[使用道具]
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发表于 2011-8-30 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
所有试剂都没有换过，酶是Fermentas的，只是不同批次订的，而且这批试剂用来扩增nptII是没有问题的，引物是干粉重新溶解了的，干粉在-20度放了大约三个月，不知道有没有问题，需不需要再重新合成试试？
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发表于 2011-8-30 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先确定引物有没有问题，看看有没有干粉引物，重新溶解再做，整个pcr体系的东西换没换，是不是还是之前用的那个公司的。  
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清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-8-30 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先确定引物有没有问题，看看有没有干粉引物，重新溶解再做，整个pcr体系的东西换没换，是不是还是之前用的那个公司的。  
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小困[使用道具]
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发表于 2011-8-30 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
详细一点：

引物序列

模板提取方法，有没有电泳鉴定

加入PCR体系的模板量

P不出来的电泳图片
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mogu[使用道具]
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发表于 2011-8-30 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢指导，问题已解决，我们是用转基因植株做的杂交，后代用抗生素筛选后的用来做PCR，原以为应该绝大部分都是阳性的，结果发现只有很少部分是目标基因PCR阳性的，当时觉得应该很多，所以做了一部分没有结果，就怀疑自己的PCR过程了。
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