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标题:【求助】miRNA的引物设计

superboy[使用道具]
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发表于 2015-8-3 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】miRNA的引物设计


请问各位专家，我是个新手，想做miRNA31的定量PCR，请问逆转录的引物与PCR的引物的序列如何设计。谢谢各位
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xue258[使用道具]
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发表于 2015-8-3 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

小RNA的引物一般都是保密的。公司有成品卖，但不公布序列。
如果你知道小RNA的序列，可以自己去合成，不过做成loop状能显著增加逆转效率。
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xue258[使用道具]
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发表于 2015-8-3 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
已知序列的miRNA 引物也是保密的啊？？ 现在的情况下，还是加个LOOP环的扩增效率高吧！，还有问题问一下楼上的大哥，一般来说，组织中的 mature miRNA在RISC复合体里面，那么我们在提取总RNA的过程中，能提出来吗？ 那么假设总的RNA提取出来了，所有的RNA在一起，miRNA会不会和相应的靶点mRNA结合呢。
最近计划从患者术后的癌症组织中提取一批miRNA做 realtime实验，取材的时候遇到问题，就是说，未经过处理的活组织RNA降解的很快，想知道这个具体是多少时间，比如取材之后组织内的RNA大概在多少分钟内降解呢，也有文章说miRNA不像其他大的RNA降解那么快，但是也不敢完全相信，因为取材这个步骤是很重要的，所以小弟我仔细斟酌了若干天，现在也没确定，恐怕需要进行个预实验来确定了。真是煞费苦心啊。
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发表于 2015-8-3 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般在标本离体后几分钟RNA就可能降解了。 现在可以用RNAlater 保存会好点。如果没有RNAlater 。那就最好是在组织离体半小时之内取了标本放液氮保存。
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xyw5[使用道具]
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发表于 2015-8-3 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
小RNA的引物一般都是保密的。公司有成品卖，但不公布序列。
如果你知道小RNA的序列，可以自己去合成，不过做成loop状能显著增加逆转效率。

====================

哪些公司有卖的呢？
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发表于 2015-8-3 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
已知序列的miRNA 引物也是保密的啊？？ 现在的情况下，还是加个LOOP环的扩增效率高吧！，还有问题问一下楼上的大哥，一般来说，组织中的 mature miRNA在RISC复合体里面，那么我们在提取总RNA的过程中，能提出来吗？ 那么假设总的RNA提取出来了，所有的RNA在一起，miRNA会不会和相应的靶点mRNA结合呢。
最近计划从患者术后的癌症组织中提取一批miRNA做 realtime实验，取材的时候遇到问题，就是说，未经过处理的活组织RNA降解的很快，想知道这个具体是多少时间，比如取材之后组织内的RNA大概在多少分钟内降解呢，也有文章说miRNA不像其他大的RNA降解那么快，但是也不敢完全相信，因为取材这个步骤是很重要的，所以小弟我仔细斟酌了若干天，现在也没确定，恐怕需要进行个预实验来确定了。真是煞费苦心啊。
你好，请问你后来问题解决了吗？？我也想到你这些问题了，不知道你是否已经找到答案了，能否共享下经验，谢谢了。
......
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-8-3 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个引物很好设计吧，有成型的技术，颈环引物，自己设计颈环，加入前mirna的序列就可以了。
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 小中大

cuturl('http://www.takara.com.cn/explain/F/RR716.PDF')
设计原则可以参考说明书，这个是基于加尾原理的，通用性更好一些。

cuturl('http://www.takara.com.cn/?action=Page&Plat=pdetail&newsid=807&subclass=1')
通常情况下，Forward Primer 序列与待测miRNA 序列基本一致，只要将原有的U 替换成T 即可。

microRNA数据库：cuturl('http://www.mirbase.org/')
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ldh[使用道具]
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发表于 2015-8-3 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

microRNA数据库：cuturl('http://www.mirbase.org/')
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summerxx[使用道具]
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发表于 2015-8-3 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是加A法的反转录，相对茎环法，加A法反转录效率更高，反转录的引物都是通用的，一般miRNA反转录试剂盒里都有，定量的引物，最好上下游的引物都是特异的，上游引物基本就是mirna的前面十几个碱基序列，在序列前面加一个tag，反向引物要加上几个特异性的碱基，如果反向引物是通用的那非特异性扩增的可能性就很高。我这有个公司的miRNA定量研究的方案，可参考一下，cuturl('http://haigene.cn/maindoc/microrna_detailes.pdf')。
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