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非常高兴看到版主在qPCR专区能成立“咖啡屋”,使我们在qPCR方面遇到问题可以相互讨论，互相学习，也便于在实验中的一些经验体会有一个交流的空间，更使我这样的
qPCR初学者多了一个“智囊团”。本人做qPCR的时间不是很长，也就是两个月吧，但其中遇到很多问题，但都一一解决，因为没有多少钱，我做的是荧光染料的PCR，这种方法最重要的一点就是对引物的要求高，我遇到的最头疼的问题就是引物经常不是出现杂带就是出现引物二聚体，温度调整了很多次都不是很好，所以换了三次引物，最后终于把引物试好了，对于引物来说，我觉得最好扩增长度在100-200之间，我们实验室几乎都是在这一范围之内，片段短了容易扩增，但也不是越短越好，如果小于100的话跑电泳可能会出现目的条带和引物二聚体重叠，这样也不利于判断有没有二聚体的存在，所以我建议如果是做染料的qPCR扩增片段最好不要小于100，然而做探针的就不存在这个问题了。扩增片段太短不好，太长也会出现一些问题，如果太长在延伸的过程中就要求延伸的时间长一些，这难免会出现杂带。从一开始做实验，向老师及同学咨询怎么摸条件的时候，他们都说在做qPCR的过程中，退火温度很重要，主要是看退火温度，出现了杂带或者二聚体就调整退火温度，所以我就一直围绕着退火温度来调整，但调了很多次仍然有一杂带，所以怀疑引物不好，但我一直忽略了延伸时间的问题，我的延伸时间用了45秒，感觉是不是太长了，所以就缩减了延伸时间，分别用30秒和25秒跑的，最后都跑出来了，并且杂带也消失了，所以我感觉在试引物的过程中，退火温度固然重要，但延伸时间也不能忽略。
这是我在做实验过程中的一点点体会，拿出来和大家分享，不知其中有没有不对的地方，也请大家给我提出宝贵意见。谢谢
