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标题:绝对定量PCR中标准品的设定问题

loli[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

绝对定量PCR中标准品的设定问题

绝对定量PCR中标准品的设定问题[转自 丁香园论坛]


以下是我制定标准品的过程:

我的标准品是选择自己pcr产物中的一种.
首先从细胞中提取RNA后,测OD260,然后反转录成cDNA.在此我时假设rna与cDNA浓度相同的. (这样是否可行呢?)
但是怎么确定标准品呢?我是这样做的,因为 绝对定量pcr设目的基因组和内参组两个组,我把所有样本按基因组(加目的基因引物)和内参组(加看家基因引物)分别在定量仪器上先跑一次pcr,然后看扩增曲线,分别选择CT值最小的(既最左边的曲线)样本做为标准品,两组的标准品基本不相同.然后在分别按浓度梯度配5组浓度递差10倍的标准组,标准品组中浓度最大的那个,浓度就是先前跑PCR 时的浓度. (第二个疑问,是否需要把这个标准品最高浓度再调高点,然后再依次稀释?) 因为要输入标准组的浓度,我输入的是按照造在本版查找到的公式:
OD260值×40×6.02×10的23次方×10的-7次方/碱基对的数目×660(即分子量)
(第三个疑问,我的目的基因是由473个氨基酸残基构成的V基因,那么碱基对的数目就应该是473×3个.那么按照上面的公式,分子量等于473×3×660等于 936540 ,可是V基因的分子量真实数据应该是52000,这里是否哪里出了问题呢?以至于计算的分子量和实际的不同)
最后开始跑绝对定量pcr,因为我的目的基因组和看家基因组各有一个标准品组,我就分别做了2次绝对定量pcr,一次是目的基因和标准组(加目的基因引物),一次是看家基因和标准组(加看家基因引物) ,然后分别分析和对比.
(第四个疑问,需要分开做吗?可不可以在一个96孔板上同时设置2组基因组和2组标准组?我曾试过,但是最后的数据却和分开做不一样,是否有某些设置?)
(第五个疑问:我见有的朋友在填入标准品的拷贝数时,设置的只是浓度数值的各个差异倍数,或者质量数,而不是拷贝数,这样是否可行呢?如果最后输入时拷贝数,那么单位应该单单是copies 还是copies/ul或者copies/ml??)

以上是一些关于我对自己实验中标准品方面的一些疑问,不知道有没有叙述清除.
希望有这方便的行家能一指迷泽,本人万分感谢~~!!
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章鱼小丸子[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、用cDNA作为标准品定量是可以的，也有这么做的，但是最好是用mRNA或者是包含你所扩增的片段的质粒作为标准品。用mRNA是因为它是你检测样品的初始形式，可以排除你在反转录过程中的误差，是定量结果更加准确，而用质粒是因为它可以长期保存，稳定。
2、作为标准品的模板对于浓度的要求不是非常高，但是要求非常的纯，不掺杂别的东西，。把它换算成为定量的单位拷贝/微升，然后把它稀释成0拷贝/微升就行了。
3、如果你的检测组和管家基因组分开做。那你用管家基因的校正功能就没有意义了，你要和你的检测组一起定量。
4、现在定量单位用的多的是拷贝/微升或者是拷贝/毫升。  
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loli[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 章鱼小丸子 于 2011-8-31 10:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、用cDNA作为标准品定量是可以的，也有这么做的，但是最好是用mRNA或者是包含你所扩增的片段的质粒作为标准品。用mRNA是因为它是你检测样品的初始形式，可以排除你在反转录过程中的误差，是定量结果更加准确，而用质粒是因为 ...

非常感谢 ,还有一个问题~如果选择cDNA做标准品,那选择哪个样本呢?是否要先做一次定量PCR然后选择CT值最小的那个(既最左边的曲线),还是任意选择呢?因为如果多做几次定量pcr,由于误差等原因ct值最小的样本可能会不同,所以这里感觉也很困难去选择~~你对于这样的选择有什么好的建议没有呢?谢谢~~
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
由于定量PCR的Ct值在13~30之间结果比较准确，如果你要做5个10倍梯度的标准品，那么最浓的标准品的Ct值最好在13~16之间。
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发表于 2011-8-31 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我同意楼上的意见，你可以选择阳性较强的模板，但是主要是比较稳定的，不会是几次检测时有时无的。
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loli[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢~上面两位朋友!

做实验的时候,为了把SYBR GREEN 1 和PRIMER,cDNA等混均,我大概在每孔轻轻吸打十次左右,但是还是不敢保证完全混均,我搜索帖子,见有的朋友使用振荡器,难道对酶没有影响么?有什么好些的方法呀~
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大虾米[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 loli 于 2011-8-31 10:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常感谢~上面两位朋友!

做实验的时候,为了把SYBR GREEN 1 和PRIMER,cDNA等混均,我大概在每孔轻轻吸打十次左右,但是还是不敢保证完全混均,我搜索帖子,见有的朋友使用振荡器,难道对酶没有影响么?有什么好些的方法呀~ ...

其实就混匀来说用枪吸打几次就可以了。如果需要，用震荡器震荡一下似乎也没什么大的问题。重要的是先混匀再分装就可以了。另外，一般低于20ul的体系混匀的确是个重要的问题。
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loli[使用道具]
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 小中大
非常感谢朋友们的相助,我完成了一阶段的实验,我做的是绝对定量~得出拷贝值的数据后,用方法1双曲线法计算基因差异性(如最下方的图),但是将浓度改成拷贝数!

然后又用2-delta delta Ct 方法计算.然后在使用使用实际扩增效率,即Pfaffi法.

但是得出的两组结果却差别比较大,我很困惑,有哪位朋友遇见过这样的问题吗?我觉得两种方法计算出的结果应该不会差别很大呀~计算的结果数据如下:

A ........ .......... B
1: 0.595 ........ 1.267
2: 0.893 ........ 1.044
3: 0.521 ........ 0.526
4: 0.798 ........ 0.550
5: 1.91 ........ 1.41
6: 1.05 ........ 0.669

其中A是用得双曲线法(将浓度改为拷贝数计算)
B用的 2 -delta delta Ct 方法
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loli[使用道具]
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 小中大
感觉两组结果相差挺大,又使用按实际扩增效率计算的Pfaffi法,结果又会变化为:
1: 0.96
2: 0.99
3: 1.11
4: 1.10
5: 1.01
6: 1.05
同样的标本,同样的反应,用不同方法分析的基因表达差异性,怎么有的样本相差这么多呢?

还有,得到的数据中,我发现在内参组里,内参处理样本和内参对照样本的最后得出的初始拷贝数/ul相差一倍,那就是说我的药物处理对内参有很大影响吗?内参不是应该很稳定不收外来因素影响的么?

谢谢热心朋友帮忙解答~~~不胜感激!!!!

图为双曲线法,计算时将浓度改为拷贝数(绝对定量使用拷贝数计算基因差异性的方法就这一种么?)


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快乐的大脚[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 章鱼小丸子 于 2011-8-31 10:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、用cDNA作为标准品定量是可以的，也有这么做的，但是最好是用mRNA或者是包含你所扩增的片段的质粒作为标准品。用mRNA是因为它是你检测样品的初始形式，可以排除你在反转录过程中的误差，是定量结果更加准确，而用质粒是因为 ...

还没有做过REAL TIME PCR，近期准备做。我有一个疑问，就是用质粒做标准品时，在做样品检测的时候是不是可以用cDNA做PCR来定量呢？如果我使用双标准曲线相对定量，我的样是经过不同时间培养的样品，其扩增片断是一样的，也就是质粒标准是一样的，那样的话不就变成单标准曲线了么？
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