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标题:求助：如何从血浆中提取高质量的miRNA？

羊咩咩[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：如何从血浆中提取高质量的miRNA？

求助：如何从血浆中提取高质量的miRNA？[转自 丁香园论坛]


我想从血浆中提取总RNA，后续试验是做对其中的miRNA作荧光定量PCR。但用了trizol 和 miRVANA paris kit以及 miRVANA iso kit(Ambion) (Ambion) 两种试剂盒，提出来的RNA的质量都不太好。260/280在1.2以下，有一次竟然还出现负数。想请教各位有什么好办法？***赐教。不胜感激。
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嘉年华[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
血浆中的miRNA量比较少，不好提。
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小困[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用SDS预沉淀和加热预处理两种方法提外周血中miRNA,后面做荧光定量PCR，但提出的RNA浓度都很低呀，而且260/280的徘徊在1.3，也提高不上去。具体步骤如下：

SDS预处理：500ul血浆样本与500ul10%SDS进行1:1混合，4度孵育1h后提取RNA.

加热预处理：500ul血浆，75度加热5-10min，42度温育1h后提取RNA。

提取RNA的步骤：向处理过的样本中加入等体积的Trizol，混匀，室温静置5min；加入1/5体积氯仿，剧烈震荡，静置2min；4°C 12000g离心15min；取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，-20°C沉淀过夜，次日4°C 12000g离心10min；弃上清，1ml 75%乙醇洗涤沉淀，4°C 12000g离心15min；弃上清，沉淀晾干后，20ul的DEPC水溶解沉淀，测浓度，便得出以上的结果。

重复三次了，结果都不理想，请高手指教！！！
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羊咩咩[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 嘉年华 于 2011-8-31 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
血浆中的miRNA量比较少，不好提。

我知道不好提，所以咨询一下各位怎么提  
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发表于 2011-8-31 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.3拍什么照样做荧光定量就可以了，我1.0做的还很好呢
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嗡嗡[使用道具]
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发表于 2011-8-31 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小困 于 2011-8-31 10:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用SDS预沉淀和加热预处理两种方法提外周血中miRNA,后面做荧光定量PCR，但提出的RNA浓度都很低呀，而且260/280的徘徊在1.3，也提高不上去。具体步骤如下：

SDS预处理：500ul血浆样本与500ul10%SDS进行1:1混合，4度孵育1h后提取 ...

不用沉淀过夜吧好像30分钟就可以了，改为80%的乙醇试试好的话回复我一个
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Biotekepeter[使用道具]
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发表于 2013-3-27 10:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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1．  离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2．  结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好，纯度高和离心柱方便快捷的优点，不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程，RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。
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请查看公司产品被引用文章：
cuturl('http://www.bioteke.com/chn/citation.asp')

[ 本帖最后由 Biotekepeter 于 2013-3-27 10:28 编辑 ]
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