小中大反應體積的改變︰通常進行pcr擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。反应体积的改变︰通常进行pcr扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。 或100ul，應用多大體積進行pcr擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。或100ul，应用多大体积进行pcr扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因︰變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低pcr擴增效率。物理原因︰变性对pcr扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。 有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是pcr失败的原因之一。
靶序列變異︰如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成左滿C靶序列变异︰如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其pcr扩增是不会成左满C
假陽性出現的pcr擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。假阳性出现的pcr扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物設計不合適︰選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行pcr擴增時，擴增出的pcr產物為非目的性的序列。引物设计不合适︰选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行pcr扩增时，扩增出的pcr产物为非目的性的序列。 靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。 需重新設計引物。需重新设计引物。
靶序列或擴增產物的交叉污染︰這種污染有兩種原因︰一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。靶序列或扩增产物的交叉污染︰这种污染有两种原因︰一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。 這種假陽性可用以下方法解決︰?操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。这种假阳性可用以下方法解决︰?操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 ?除黴及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。 ?除霉及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。 所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 ?必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 ?必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。 二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。二是空气中的小片段核酸污染，??这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。 可互相拼接，與引物互補後，可擴增出pcr產物，而導致假陽性的產生，可用巢式pcr方法來減輕或消除。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出pcr产物，而导致假阳性的产生，可用巢式pcr方法来减轻或消除。
出現非特異性擴增帶pcr擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。出现非特异性扩增带pcr扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 非特異性條帶的出現，其原因︰一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。非特异性条带的出现，其原因︰一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。 二是mg2 離子濃度過高、退火溫度過低，及pcr循環次數過多有關。二是mg2 离子浓度过高、退火温度过低，及pcr循环次数过多有关。 其次是黴的質和量，往往一些來源的黴易出現非特異條帶而另一來源的黴則不出現，黴量過多有時也會出現非特異性擴增。其次是霉的质和量，往往一些来源的霉易出现非特异条带而另一来源的霉则不出现，霉量过多有时也会出现非特异性扩增。 其對策有︰?必要時重新設計引物。其对策有︰?必要时重新设计引物。 ?減低黴量或調換另一來源的黴。 ?减低霉量或调换另一来源的霉。 ?降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。 ?降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ?適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。 ?适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出現片狀拖帶或狻棱a出现片状拖带或狻棱a
pcr擴增有時出現狻棱a或片狀帶或地毯樣帶。 pcr扩增有时出现狻棱a或片状带或地毯样带。 其原因往往由于黴量過多或黴的質量差，dntp濃度過高，mg2 濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其原因往往由于霉量过多或霉的质量差，dntp浓度过高，mg2 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 其對策有︰?減少黴量，或調換另一來源的黴。其对策有︰?减少霉量，或调换另一来源的霉。 ?減少dntp的濃度。 ?减少dntp的浓度。 ?適當降低mg2 濃度。 ?适当降低mg2 浓度。 ?增加模板量，減少循環次數。 ?增加模板量，减少循环次数。
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