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标题:【求助】巢式PCR

西子[使用道具]
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发表于 2015-8-5 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】巢式PCR


哪位大侠能提供比较详细的介绍巢式PCR的文献和资料呀，
有经验之谈更好，多谢！
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-8-5 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
巢式PCR和普通PCR在反应原理上是相同的 不同之处在于 巢式PCR第二轮的模板不是全部CDNA 而是第一轮反应后的产物（通常取第一轮反应的1/10作为第二轮反应的模板)
我做过巢式 放大作用非常明显 外引物扩增跑胶完全见不到条带的情况下 用内引物扩增可以见到明显的条带 但假阳性的可能性也大大提高 操作时要避免交叉污染
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any333[使用道具]
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发表于 2015-8-5 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。
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u234[使用道具]
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发表于 2015-8-5 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想请教几个问题。
第一轮PCR循环次数不能太高吗？我用了40，电泳结果看不出有什么东东。
第二轮PCR后却让我大失所望，结果特异的条带非常不明显，托尾现象及其严重。见图为退火温度梯度的PCR，不论退火温度的高低，特异条带都不明显。
各位能帮忙分析一下影响因素吗？多谢了！


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caihong[使用道具]
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发表于 2015-8-5 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想请教几个问题。
第一轮PCR循环次数不能太高吗？我用了40，电泳结果看不出有什么东东。
第二轮PCR后却让我大失所望，结果特异的条带非常不明显，托尾现象及其严重。见图为退火温度梯度的PCR，不论退火温度的高低，特异条带都不明显。
各位能帮忙分析一下影响因素吗？多谢了！
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发表于 2015-8-5 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DNAgirl你的问题我之前也遇到过，无论怎样优化都一样，总是有大量的smear，做了两个月都没有结果，一度认为是引物的问题。今年开年很快就做出结果了。我觉得操作是很重要的。
1一定要在冰上加样，直接用冰块比用冰盒好
2在混合物分到各管前一定要用枪吹打混匀（这步尤其重要）只是用flash甩是不够的，好像酶比较重都沉到管底了
3适当延长退火时间，我p的片断四百多，用了1min
4延伸时间也可以延长，我用了1。5min
5直接把第一轮产物取1ul作为第二轮模板
6第一轮产物跑电泳可能什么都看不到
我的小小经验，别气馁，祝你好运了！
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-8-5 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是你说的某些我都注意到了，PCR 我是在冰上做的；
分装时确实也是用枪反复吹打的，
只是退火用了40s；延伸用了1min；
第二轮的模板加了0.5ul，不过我想这个是与第一轮的产物量有关，因此我也做了一个模板浓度梯度，但是都是稀释第一轮的产物来用的，难道是我的模板太低了？我会再试！
第一轮PCR 确实什么都没有。
我已经试了很多很多边了，结果使我不得不怀疑到引物，想重新设计了。依你的经验，重新燃起了希望之火，我决定再试试！
希望能跟你一直交流，呵呵！
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
到现在为止，重复了很多次。第二轮PCR结果仍然特异性不明显，但预计四百多的条带还是有的，疑惑的是每个样品都有一条两百左右的带，难道是特异扩增，引物还是有问题吗？见图。我又设计了第三对PCR引物，以第二轮PCR产物为模板，结果还是如此啊！！请指教。多谢！


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gogo[使用道具]
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发表于 2015-8-5 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也可能是网上公布的序列有问题，只能多设计几个引物，来试了，不得不辛苦了。
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shenkunjie[使用道具]
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 小中大
可能是引物的问题，再检查并对引物进行blast一下。做PCR的时侯还应该注意不要交叉污染了。
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