【求助】pcr引物二聚体条带很亮，没有目的条带

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标题:【求助】pcr引物二聚体条带很亮，没有目的条带

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发表于 2015-8-5 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友，我做pcr扩增700多bp的条带，退火温度59°，延伸时间1分30秒，引物二聚体很亮，没有目的条带，不知道是怎么回事，我的引物碱基长度是26个bp.marker的最后一条是100bp

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2015-8-5 15:18

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发表于 2015-8-5 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

会不会引物都结合成二具体了所以没有扩增出目的片断啊

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发表于 2015-8-5 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物我用oligo评价过，还可以啊，也在NCBI上blast过啊，应该没问题，现在就是说都是二聚体，没有目的条带

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发表于 2015-8-5 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的情况和你一样，是不是要换引物呀，可我的引物是Takara设计的，后来我也Blast一下，也正确，不知道为什么就P不出来目的条带，真的很郁闷

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发表于 2015-8-5 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

此问题是常见的PCR无结果，建议楼主在本板块内搜索，有很多类似的帖子。
原因无外乎：
1. 退火温度设置不合理，采用梯度PCR可进行改进。
2.模板问题，如模板降解，浓度过低。
3.试验操作问题，操作不熟练。
4.机器问题，现在越来越多的问题好像是PCR仪的问题，呵呵
5.引物问题应该很小，有如此明显的2聚体，说明无降解，重新合成暂时无必要~

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发表于 2015-8-5 15:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我退火温度59°，按照引物合成报告单上进行，
模板我扩增其它的目的基因是没问题，应该没有降解
实验操作熟练度话和机器应该还可以，其它的都能扩出来
我现在继续在扩，改变了一下条件，等出来结果看看

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发表于 2015-8-5 15:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天把引物浓度降低为终浓度0.5uM，可能以前浓度加的太多了大概今天的十倍，今天扩的到时没有引物二聚体了，但是又出来了非常亮的非特异性条带，不知道为啥么？我退火温度60° ，延伸时间为2min, 30循环

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2015-8-5 15:21