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标题:甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)

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甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)

甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法) [转自 丁香园论坛]



甲基化是目前的研究热点,就我所做的一点工作并其中一点心得,与大家分享。希望能够对大家有所帮助。
第一部分 基因组DNA的提取。
这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节:
1:蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;
2:RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二:
1:紫外分光光度计计算OD比值;
2:1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。
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第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水(DDW)均经高压蒸汽灭菌。
1:将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul;
2:加5.5ul新鲜配制的3M NaOH;
3: 42℃水浴30min;
水浴期间配制:
4:10mM对苯二酚(氢醌),加30ul至上述水浴后混合液中;(溶液变成淡黄色)
5: 3.6M亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6:EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液。
7:加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化。
8:50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适。
这一步细节:
1:基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug。
2:所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确。
3:亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
4:水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。
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手工修饰么?
学习中!!
请楼主继续!
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很有用!希望继续讲下纯化步骤。
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QUOTE:
原帖由 不懂 于 2011-8-31 15:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
手工修饰么?
学习中!!
请楼主继续!  

显然是手工修饰。
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第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。
2:以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统(Promega,A7280)
1)70℃水浴预热DDW;配制80%异丙醇;
2)加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合;
3)由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便;如果没有,需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
4)将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80%的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。
5)将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥。此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态。
6)将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min。
7)离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul。
3:加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min。
4:加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右。
5:加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说。不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧。
6:加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验。如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧(这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了)
7:4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀。不必吸净。
8:加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min。离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍。此为洗涤步骤,共2次。
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9:倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul-30ulDDW,溶解沉淀。至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验。
10:-20℃保存DNA溶液。

此步细节:
1:在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用。
2:乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出。
3:异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便。
此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了。
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谢谢楼主,很好的protocol。
请问你的阳性对照用的什么呢?怎么做的继续给大家讲下吧!
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第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题:
1:引物问题:我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题。如果不是这样,还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询。查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强。我也是按此行事,算比较顺利。
2:Taq酶问题:有文献用高保真的金牌Taq(Platinum),但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择,可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
3:PCR的条件:变性一般都选择95度,3min。其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。
4:做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行。
5:PCR仪:如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递。
这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验。有疑问处,请大家指出,交流。今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。
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QUOTE:
原帖由 花裙子 于 2011-8-31 15:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢楼主,很好的protocol。
请问你的阳性对照用的什么呢?怎么做的继续给大家讲下吧!  

回答:我做的是测序的方法,没有使用阳性对照。只有阴性对照,不加模版。比较顺利的扩出了目的片段,并且经测序证实。查阅文献,此方法也少有阳性对照。如果做MSP,可能是需要的。
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