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标题:求助：重叠PCR奇怪的现象

魔法师A[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：重叠PCR奇怪的现象

求助：重叠PCR奇怪的现象 [转自 丁香园论坛]


本人将三段基因利用重叠PCR拼接在一起，大小分别是900，700，400。我的方案是先加入三段摸板，酶。先做了10个循环。 再加入目的连接片段两端的引物，补入酶，做25个循环。最后发现在2000BP处有明显的目的条带（图一，较亮的带的上面的那条）。于是我将目的条带切下来，胶回收，再以两端的引物PCR，发现没有条带。或者直接以第一次的PCR产物为模板，都没有得到预想的目的条带。请高手指教啊，这是为什么呢？


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2011-9-2 17:53
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魔法师A[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
图2，进一步扩增的图。MARKER后一二道是以胶回收片段为模板做的，第三道是胶回收条带，第四，五道是以第一次PCR产物为模板做的，都没有预期的结果啊


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嘉年华[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你重叠区域的碱基对是多少？
只要重叠碱基合适，模板和引物放一起直接扩，不用像你搞得那么麻烦。
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发表于 2011-9-2 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
重叠区域有40多个，应该是够了。最开始直接就加模板也做过，但是效果不好，目的带很淡
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按秒计算[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到了这现象了啊
真是郁闷，正愁呢啊！
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发表于 2011-9-2 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到相似现象，做了一个月了，不知道怎么办，很郁闷
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发表于 2011-9-2 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你的PCR出现很弱的目的条带，你可以用PCR产物直接再做，必要时调整退火温度！一般都可以的！祝实验顺利
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发表于 2011-9-2 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在做重叠PCR，一个多月了，没有什么进展，我的是三段引物，均是50多bp，发现任意两端放在一起都会形成引物二聚体，我现在是把引物1和2放在一起PCR，然后再直接取P好的混合物和引物3继续PCR，第二次PCR时发现目的条带很淡，很亮的是引物二聚体，我也不知道该怎么办了，楼上有高人说目的条带很淡也可以，想请教下这个方法具体该怎么实施  
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大猫[使用道具]
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发表于 2011-9-2 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一下仅做参考：
1确定三段是否是目的基因。
2分析三段片段的结构和gc，看看片段之间有没有重复片段
3分段搭接，根据gc采用合适PCR体系。
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糊涂虫[使用道具]
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发表于 2011-9-2 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人意见，仅供参考：
1、不用做前面的那10个预循环，直接重叠。
2、用好点的pfu酶（如果不行就加一点taq），循环数做多一点的
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