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标题:求助：pcr产物酶切后电泳不出条带

蛐蛐儿[使用道具]
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发表于 2011-9-3 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：pcr产物酶切后电泳不出条带

求助：pcr产物酶切后电泳不出条带 [转自 丁香园论坛]


我最近做PCR后酶切，出现两个问题求各位帮忙解决
1 PCR产物酶切后，电泳不出条带，不管是直接用PCR产物，还是乙醇沉淀后的产物，酶切后都出不来条带。我用的酶是AciI，取10ULpcr产物，0.5ul酶，2ul的NEB缓冲液，7.5ul超纯水，37度3个小时。
2 还有一个奇怪的现象，就是我第一天pcr的条带很浅或没有，我第二天把前一天的pcr产物，什么也不加，直接放到仪器里，再做PCR，电泳条带就很清晰很亮，也是我要的目的条带。这样两次PCR的可以用不
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-3 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以用PCR产物当模板接着做PCR，但是没有听说过再进行一次PCR的，不过，既然是目的带，应该就可以用吧！切没的情况，我们实验室也有人遇到过，但是换成小体系就没事，大体系就有时有问题！
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发表于 2011-9-3 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，可是我的20ul已经很小了，难道做10ul的吗，那样只够跑电泳的啦。是不是PCR后的产物要直接做酶切那，我的负20放了两三天才做的，难不成是降解了
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小葵[使用道具]
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发表于 2011-9-3 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得再一次的可以用 你确保第一次的仪器调置上没有问题的话 只要批出来了就可以用
还有我要问的是即使你切出来了 是不是你只可以从大小上判断啊？pcr 产物不是线性的吗？会切出来两条带吗?
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发表于 2011-9-3 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你酶切的目的是什么
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发表于 2011-9-3 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我酶切的目的是检测基因型的，如果没有突变会跑出来两条带的
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发表于 2011-9-3 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有那位大侠帮帮忙那，我做了好几遍了，酶切后都不出条带，愁死我了，这九月份要考执业医，实验搞得我一点也看那不了书
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发表于 2011-9-3 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
-20放几个月都没有问题的，恩，20ul可以了，酶是按说明书加的吗？有点少吧！还有你做20的，可以分到两个小管里切，我们经常是做了大体系的再分到小管里，每管10ul，感觉效果都挺好的！
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蛐蛐儿[使用道具]
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发表于 2011-9-3 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是按说明书上加的，昨天只是做了10ul的，还是什么条带都没有，我就奇怪啦，没有切开的话，最起码也应该跑出原来的条带来啊。今天试试你说的分装小管的方法
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loli[使用道具]
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发表于 2011-9-3 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酶切时间不够，延迟时间37℃过夜，另外酶切后电泳时上样量一定要多，胶做厚点
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