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申报资料要求解读之二 ——哺乳动物传代细胞鉴别试验方法简介
[摘要]：随着对基因工程蛋白药物的深入研究和应用需求，哺乳动物传代细胞越来越多的应用于生物制药领域。由于我们对基因工程蛋白表达体系的认识还有许多未知的因素，仅仅在终点控制蛋白质量是远远不够的，过程控制非常重要。这就要求在研发之初就要了解所选择的哺乳动物传代细胞的背景、来源，并对其进行充分的鉴别试验，以确认该细胞。包括验明细胞的种属来源，分析细胞的同一性，检测与其它细胞的交叉污染情况。此外，在生产细胞传代过程中，还应对细胞本身的特性进行监测，注意培养过程中生产细胞本身的变化，以控制生产工艺步骤和确定细胞最高传代次数。目前，常用的细胞鉴别试验方法包括细胞形态学检查、种属特异性抗原的检测、染色体核型分析、同功酶分析、限制性内切酶分析等等。本文就此进行简要介绍。
随着对基因工程蛋白药物的深入研究和应用需求，哺乳动物传代细胞越来越多的应用于生物制药领域。哺乳动物细胞作为生产基因重组蛋白药物的表达工具，仅仅满足目的蛋白的产量和活性要求是远远不够的。由于我们对基因工程蛋白表达体系的认识还有许多未知的因素，仅仅在终点控制蛋白质量是不可行的（实际上，目前的研究水平，也不能象化药一样完全控制），因此过程控制非常重要。这就要求在研发之初就要了解所选择的哺乳动物传代细胞的背景、来源，并对其进行充分的鉴别试验。
据Hukku B的研究报道，该实验室使用多种方法对275个细胞株进行鉴定（如，特异性种属抗原、同功酶表型、染色体 complement和HLA haplotype），结果有35％发现了交叉污染，包括种属内和种属间的污染；2003年的一篇文献报道，采用细胞特定基因的PCR方法，检测了82个细胞株，交叉污染现象占到了5％－10％。因此，对细胞的鉴别应引起足够的重视。
根据GLP原则和生产实践的要求，用于建立MCB和WCB的哺乳动物细胞基质，也就是宿主细胞应全面进行鉴别，以确认该细胞。包括验明细胞的种属来源，分析细胞的同一性，检测与其它细胞的交叉污染情况。此外，在生产细胞传代过程中，还应对细胞本身的特性进行监测，注意培养过程中生产细胞本身的变化，以控制生产工艺步骤和确定细胞最高传代次数。
细胞鉴别试验的方法有多种，根据检测目标分类包括细胞水平（形态、分类特征）、染色体水平、分子水平（生化、酶学、分子生物学特征）；根据方法学分类，包括细胞遗传学检测，免疫学检测，生物化学检测和分子生物学检测等。根据目前的文献报道，常用的方法包括细胞形态学检查、种属特异性抗原的检测、染色体核型分析、同功酶分析、限制性内切酶分析等等。
细胞形态学检查：
通常在细胞接种24小时和48小时后，用100倍显微镜检查，观察细胞在低密度和高密度生长时的形态。这种方法比较直观，但只是一个比较粗略的鉴别方法，并且与检测人员的经验密切相关。
种属特异性抗原检测：
也就是用种属特异性抗血清来检测种属特异性抗原，比如间接免疫荧光抗体染色。这种方法操作起来比较简单，但是试验敏感性较差，也就是如果存在少量的细胞污染不能分辨出来。
染色体核型分析：
多数情况下，不同细胞的染色体结构是有明显差别的，因此可以利用这些差别进行细胞种属的鉴别。但是需要提醒的是，亲缘关系接近的灵长类动物细胞的染色特征就比较接近，因此要注意仔细辨别每一谱带的特点。试验时，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体标本片。染色体标本应长期保存（直至褪色不能用为止），以备复查。药典三部中详细描述了人二倍体细胞染色分析的方法和标准，可以参考，这里就不再赘述。染色体核型分析是一个比较精确的检测方法，但试验操作比较复杂，需要对试验人员进行培训。
同功酶分析（Isoenzyme Analysis）：
通常，不同种属的细胞所表达的同功酶是不同的，因此可以利用同功酶分析来进行细胞的鉴别。该方法通常检测以下四种同功酶：葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD）、乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）和核苷磷酸化酶（NP）。检测试剂盒和装置可以向Authentikit生产商购买，当然也可自建方法检测。试验时，通常要设一个小鼠源细胞（如L929细胞系）标准品和人源细胞（如Hela S3细胞系）的对照品。该方法是目前国外对重组制品哺乳动物细胞基质的主要鉴别方法，由于其有商品化的检测试剂和仪器，因此检测性能比较可靠，但是价格比较昂贵。下表1是Authentikit试剂四种同功酶的电泳迁移距离，可以参考：
