求助：低表达基因如何消除融解曲线双峰？

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标题:求助：低表达基因如何消除融解曲线双峰？

panda王[使用道具]
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发表于 2011-9-5 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助：低表达基因如何消除融解曲线双峰？

实验分两组：同一目的基因，两组的扩增曲线都很好，高表达组融解曲线呈单峰，但低表达组融解曲线呈双峰，两者行琼脂糖电泳均为单一目的条带，未见杂带。
请教一下，出现这种情况是否是引物二聚体引起？应该怎样解决？
谢谢！

[ 本帖最后由 panda王于 2011-9-5 15:26 编辑 ]

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miracle 2011-9-5 15:23 可用分 +1 请不要在标题或内容带来“转自丁香园”字样 ...

阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-5 15:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

贴个图先。
如果电泳表明没有杂带，那么融解曲线应该是单峰的。不知你所说的双峰形状如何，是否为系统的随机波动

大仙[使用道具]
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发表于 2011-9-5 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

融解曲线的情况和电泳的结果有时并不一样，我做个一个标本有几个峰的，其中包括有目的片段片段的，还有引物二聚体的，还有其他不知道是什么引起来的峰，跑电泳一看什么都没有，按理论说，有目的片段跑电泳应该有结果的。

跳跳糖[使用道具]
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发表于 2011-9-5 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也遇到过这种现象，溶解曲线上看有较宽较高的杂峰，怀疑是引物二聚体，跑琼脂糖电泳，引物二聚体其实并不是很明显，只是有模糊稍亮的一片带。
我是通过调整信号收集温度来解决这个问题的：首先，作溶解曲线分析，看一下杂峰与主峰的Tm值，例如75度之前有杂峰，75度之后有主峰，那么，在PCR循环时收集信号时的温度调成75度（或者专门加一个step在此专作收集信号用），这样在75度时只有目的片段的信号是想要的，杂峰都解成单链，没有荧光信号的。

panda王[使用道具]
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发表于 2011-9-5 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢！
就是说在延伸后把温度调到主峰Tm值附近的温度收集荧光？

panda王[使用道具]
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发表于 2011-9-5 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

附上扩增曲线及溶解曲线