小中大巧用PCR—复杂质粒构建策略中的PCR应用
巧用PCR—复杂质粒构建策略中的PCR应用[转载]
复杂的克隆策略是指在一个载体上进行插入、替换或删除等多次重组操作或根据需要从头构建一个质粒载体等操作。对于传统的克隆策略来说，每进行一次插入、替换或删除操作就要进行一次酶切——连接——转化——培养细菌——提质粒——酶切鉴定的循环，费时费力，中间的大部分时间花在等待细菌生长上，效率很低。随着PCR技术的发展和成熟，我们不断地对传统的方法进行改革，使重组质粒的构建不断简化，效率不断提高。
例：变几个相邻片断的多步分别克隆为一步克隆
目的：把A 、B和C三个片断以首尾相接的方式插入质粒载体。
传统方法：首先分别PCR扩增片断A、B、C, 然后克隆片断A，然后克隆片断B，最后克隆片断C。中间需要完成三个酶切——连接——转化——培养细菌——提质粒——酶切鉴定的循环，花在细菌生长上的时间超过60小时。
改进方法：首先分别PCR扩增片断A、B、C, 然后把三个片断分别酶切，在体外连接，以连接产物为模板，以片断A的上游引物和片断C的下游引物为引物进行PCR扩增，把得到的PCR产物一步克隆到质粒载体中。
两种方法所得到的结果是一样的，但是改进方法所化的时间为传统方法的三分之一，只需要一个酶切——连接——转化——培养细菌——提质粒——酶切鉴定的循环。
上述例子只是一个简单的应用，我们实验室在重组质粒构建过程中大量的应用长片段高保真PCR，重组质粒的构建模式发生了很大的改变。随着PCR技术的不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构建过程的大多数细胞内的DNA复制将被PCR这一细胞外的DNA复制所代替，质粒构建效率将有质的飞跃。
