小中大⑤引物的3’末端核苷酸组成
引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的,而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多,通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补,尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现,这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态,从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定,一般考虑末端5个碱基的ΔG。此值的大小对扩增有较大的影响,负值大,则3’末端稳定性高,扩增效率更高,同时也更易于异位引发。
需要注意的是,引物3’末端应尽量避免T。实验证明,以T结尾的引物即使与T, G或C错配仍可有效延伸。
⑥PCR产物的长度及在耙序列内的位置
所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。一般说来,PCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下,PCR产物长度部分取决于模板材料。
预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法,120~300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率,并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到,从而减少扩增时间。
其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如,通过定量的RNA-PCR检测基因表达时,产物应该足够大以便构成竞争性模板,这样,产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在250~750bp范围内。