求助：半定量RT-PCR内参照设立问题

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 求助：半定量RT-PCR内参照设立问题

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:求助：半定量RT-PCR内参照设立问题

长发piaopiao[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 72163
精华 0
积分 143
帖子 66
信誉分 100
可用分 1036
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态离线

发表于 2011-9-5 17:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助：半定量RT-PCR内参照设立问题 [转载]

我预备作半定量RT-PCR实验，主要目的是看一组基因在肿瘤细胞和正常细胞之间的表达差异。
我已购买了Promega公司的一步法RT-PCR试剂盒（A1250），察看文献多次提到了用beta-actin作为内参照，不慎理解。有几事请教大家：
1.beta-actin在半定量中是否必需？怎样设计这对引物，此引物在不同种系、人与动物之间是否有区别？设计这对引物有何特殊要求？
2.Promega试剂盒中带有一对引物，这对引物的作用和beta-actin有和区别？能否代替beta-actin？

蛐蛐儿[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 72042
精华 0
积分 131
帖子 42
信誉分 100
可用分 901
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态离线

发表于 2011-9-5 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

问：beta-actin在半定量中是否必需？
答：beta-actin是细胞是一种细胞骨架蛋白，在细胞中稳定表达，且表达良较高。是RT-PCR中常用的内参照。你要半定量当然必须了，可以消除操作中的误差，并做为半定量的标准！另外半定量还可以用G3PDH，G6PDH等。
引物当然是种属不同而不同了，如果你要做人的样品就用人的beta-actin引物！
beta-actin引物不用设计，很多半定量RT-PCR的文献上有现成的引物序列！

good luck！

阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态离线

发表于 2011-9-5 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

A1250自带的引物不能用来代替beta-actin的引物，那对引物是用来作为阳性对照的。

长发piaopiao[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 72163
精华 0
积分 143
帖子 66
信誉分 100
可用分 1036
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-5
状态离线

发表于 2011-9-5 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢楼上几位朋友的热心帮助，我们好几个人的试验都是用这个方法，这些问题我们探讨了好久，现在终于搞清楚了，我代表我们几个同学感谢你们。