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标题:长片段RT--PCR的可重复性是100%吗?

she[使用道具]
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长片段RT--PCR的可重复性是100%吗?

长片段RT--PCR的可重复性是100%吗?[转自 丁香园论坛]


that is to say,相同的条件下,每次都可以得到相同的条带吗?还是具有偶然性?静侯各位经验同道赐教!加急,谢谢!
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微笑的海豚[使用道具]
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理论上应该是,但是实际上哈哈
我想问问你你的扩增条件?你扩的是多长的片断?
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米米[使用道具]
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PCR重复性也可以看作一种指标,好的设计和反应重复性好,反之亦然  
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森林木[使用道具]
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我在扩增一4kb时,发现有时能扩出来,有时不能(条件一样),之后,我用PCR产物作模板,进行PCR,居然得到一个比原片段还大的产物,该产物只在加样孔位置,不能在电场中移动,我用的胶的浓度为0.8%.这到底是什么回事,我还没搞清楚。
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米米[使用道具]
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这种现象我没有遇到过,无法确定你看到的加样孔前缘发亮是否是一条带,就现在的PCR扩增能力来说,达到30-40Kb已经不容易了,但30-40kb从加样孔中出来是很容易的,象你描述的这种现象用PCR扩增产物来解释(即使是非特异的)不知是否合适。
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森林木[使用道具]
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这种现象我没有遇到过,无法确定你看到的加样孔前缘发亮是否是一条带,就现在的PCR扩增能力来说,达到30-40Kb已经不容易了,但30-40kb从加样孔中出来是很容易的,象你描述的这种现象用PCR扩增产物来解释(即使是非特异的)不知是否合适。  

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说得有道理,在电泳之后,我在加样孔位置看到很亮的荧光,其亮度很强,但由于是在加样孔的位置,所以,我不能说它是一条带。从PCR原理解释,也是说不通的。我曾考虑是不是由于产物之间互相交联,形成一种很大的复合物,我就将PCR产物加热,94度2分钟。结果仍然一样。我把这一现象告诉我的同学,他们建议我把产物纯化后再进行电泳,也有叫我把产物拿去测序的,因为我的课题目的不在于此,今后也可能不再从事这方面的研究,所以就没去管他。这次可惜我没照相,下次如能再出现这样的结果,我就把他照下来,提供大家讨论。
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对,这种现象其实不影响后面的实验,不必太在意,不过,讨论一下很有意思,毕竟以前没有考虑过这类问题。
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she[使用道具]
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我所扩最长片段为6.5kb,也遇到过加样孔处的亮线,我当时想可能是污染,即非特异性带。
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