【求助】细胞不同部位蛋白的提取方法

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标题:【求助】细胞不同部位蛋白的提取方法

shkudo[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问一下细胞不同部位蛋白的提取方法，最近看了一些文献，比如细胞的总蛋白，膜表面蛋白，胞浆蛋白，胞核蛋白，似乎都有不同的提取方法，不知道有没有高手可以告知具体的步骤和大致的原理，非常感谢了。

JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有通用的蛋白抽提试剂盒：分胞浆蛋白和核蛋白两种

youyou99[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

以下是我们实验室用到的方法，屡试不爽，相关成果发表在Molecular Cell上。
Chromatin Fractionation
1．about 3 × 106 cells were washed with PBS and resuspended in 200 ul of buffer A (10 mM HEPES (pH 7.9), 10mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.34 M sucrose, 10% glycerol, 1 mM dithiothreitol,0.1% Triton X-100 and protease inhibitor mixture (Roche Molecular Biochemicals).
2. the cells were incubated for 5 min on ice.
3.Nuclei were collected in the pellet (P1)by low speed centrifugation (1500 × g, 4 min, 4 °C).
4.The supernatant(S1) was further clarified by high speed centrifugation (13,000 ×g, 10min, 4 °C) to remove cell debris and insoluble aggregates. The supernatant was designated S2.
5.Nuclei were washed once with buffer A without 0.1% Triton X-100 and then lysed in 200 ul of buffer B (3 mM EDTA, 0.2 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, and protease inhibitor mixture).
6.After a 10min incubation on ice, soluble nuclear proteins (S3) were separated from chromatin by centrifugation (2000 ×g, 4 min).
7.Isolated chromatin (P3) was washed once with buffer B and spun down at high speed (13,000 ×g,1 min).
8.remove soup and restore the pellet(P3) in 200ul sample buffer.

ending[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那请问楼上的S2就是胞浆蛋白吗？

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ending 于 2015-8-10 17:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那请问楼上的S2就是胞浆蛋白吗？

胞浆可溶性蛋白。

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我曾看过一篇文献，用western blot方法分别检测了线粒体内cyto c和线粒体体外的cyto c的量，请问这个是用什么方法分别获得线粒体内、外总蛋白的呢？

windy+++[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般来说,提细胞蛋白可以分成以下几种:总蛋白,核蛋白,胞浆内活性酶及膜蛋白等.总蛋白,一般加上样缓冲液煮煮就完事了,如果不能变性,那就用RIPA;核蛋白,市场上有专门的提取KIT,自己配试剂有点麻烦;胞浆内的活性酶,需要用不含变性剂的非常温和的缓冲液,市场上也有相应的KIT,要注意的就是让你的目的蛋白不变性,少变性;膜蛋白提取是最麻烦的,含量少,不容易被溶解,一般用NP-40,RIPA等或者一些成品KIT,但有些膜蛋白非常顽固,需要试一些去垢剂,但如果,不需要在意膜蛋白的结构,那么就使劲让它溶解变性吧,但别弄沉淀了.

chengjie79[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实并不是根据细胞部位分的，而是根据蛋白性质，比如常用的percoll，
根据部位的话很难，最多也就是先吧细胞核分出来

chengjie79[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 youyou99 于 2015-8-10 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

以下是我们实验室用到的方法，屡试不爽，相关成果发表在Molecular Cell上。
Chromatin Fractionation
1．about 3 × 106 cells were washed with PBS and resuspended in 200 ul of buffer A (10 mM HEPES (pH 7.9), 10mM ...

请问与chromain紧密结合的蛋白，你们怎么提取？
貌似你说的这篇文章我看过，但是我不太明白与chromain紧密结合的蛋白，你们怎么提取的？

youyou99[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用SampleBuffer直接溶解染色体结合蛋白 as indicated above with "P3"

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