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标题:RT-PCR讨论区

荷塘青蛙！[使用道具]
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发表于 2011-9-6 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

RT-PCR讨论区

RT-PCR讨论区 [转载]


大家做RT-PCR的比较多，我认为有必要建立一个专区，这样大家能在这里有目的地交流。现搜集了一些帖子，供大家学习参考，更欢迎同胞们踊跃提问，积极发言~希望大家能多多交流！大家来支持。

[ 本帖最后由 荷塘青蛙！ 于 2011-9-6 14:54 编辑 ]
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fangxiang[使用道具]
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发表于 2011-9-6 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RT-PCR技术

本人自认为在RT-PCR方面有不少经验.想当年,为了得到可溶性HLA-G分子的CDNA, 没日没夜的批,每次都是另人垂头丧气. 直到有一天.......有了.将近三个月哪! 可现在想起来,有付出总有收获,所以现在对RT-PCR可谓是小菜一碟, 管你基因再复杂! 所以本人愿意与大家讨论.
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发表于 2011-9-6 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RNA电泳出现4条带，请问最可能是什么？

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转帖：RT-PCR实验有三步较为关键：抽提RNA，RT，PCR。
我的建议是：1. 做RT前最好测一下RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，我的印象是至少大于1ng。
            2. RT按要求做，一般不会出太大问题。但完成后最好也测一下cDNA浓度。
            3. 不知你的PCR产物多长？如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
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发表于 2011-9-6 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能不能在这里讲讲RT-PCR的经验？
比如如何避免RNA降解？制胶的方法，注意事项？
我在实验时，有时RNA提不出，方法没区别，但找不到原因。跑出来的胶总是不够直。虽然图像分析能弥补一点，但总觉得不够好，也不知应如何处理。
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荷塘青蛙！[使用道具]
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发表于 2011-9-6 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是这里的新人，也是分子生物学方面的新手。
我的几个问题如下：1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？2）RT-PCR 的说明书上写，在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，那么其他非目的基因不是也会RT和PCR吗？那么电泳后又怎么知道哪个条带是所要的目的片段呢，它的预期大小又是多少呢？3）如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？4）是不是可以完全参考相关实验内容的文献给出的引物进行我的实验呢？
我希望朋友能指点我，虽然这是一些很菜鸟的问题！谢谢！


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PCR 或RT-PCR时扩增的是两引物之间的一段基因序列，做pCR一般来说要知道目的基因的序列或氨基酸序列，但反向PCR可以扩增已知序列以外的序列。
PT-PCR在逆转录阶段，应用不同的引物扩增的片断可能不同，但在PCR阶段它只是扩增你的上下游引物之间的片段，PCR经过25-30次循环后你所要的基因片段得到大大的扩增。电泳时如果没有意外的话应用一条条带，并且在大小相同的mark处。
到参考文献查相应的引物，国外的文献，参考价值大，但自己还是要看一看。
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发表于 2011-9-6 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是分子生物学方面的新新新手: 请教 :

本人最近做大鼠实验，有一问题请教各位，取大鼠肝脏做RT-PCR，是否需要对大鼠肝脏进行灌洗处理？如需灌洗则是否是从股动脉或颈动脉放血后，从肝动脉进行冲洗？用生理盐水做冲洗液是否可以？不灌洗，取小块肝脏后，用生理盐水冲洗后放入液氮中是否就可以用来提取RNA？

thank you for help!
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发表于 2011-9-6 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位专家，你好！我是一名分子方面的新手。有个问题想请教大家，还请不吝赐教！
我正在作一个有关慢性粒细胞白血病BCR-ABL 融合基因的课题。我通过RT-PCR扩增出了产物，想通过测序来证明产物为BCR-ABL融合基因的cDNA.但是通过PUBMED，只能查到BCR-ABL mRNA（编码P210蛋白） 或cDNA的部分序列，无法查到完整的全部序列。不知专家们能否帮忙查查？
多谢！
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发表于 2011-9-6 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
小鼠肝脏取下来直接做RT-PCR就可以的。
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-6 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
取大鼠肝脏做RT-PCR，是否需要对大鼠肝脏进行灌洗处理？
可以不灌洗，但是一般用DEPC处理过的PBS漂洗，尽量滤干水分，液氮速冻-80保存或直接提取。

是不是可以完全参考相关实验内容的文献给出的引物进行我的实验呢？不可以，因为个人的实验目的不同，且文献可信度？？

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须

在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov')
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王六六[使用道具]
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 小中大
不知这位台兄用的什么试剂提取RNA。本人用的是Gibco的Trizon试剂。一般所用器材如tip头等都是未开包的，用DEPC处理太麻烦，如果是新的，不用处理，高压时间长一点即可。试剂都应是新的，并且RNA专用，当然也要注意实验环境，特别是离心机等的清洁。一般不会出现降解。本人有一RNA电泳图，还不错，如需要，可赠送。至于胶跑不直，可能是制胶问题，如未使琼脂糖完全融化，导致胶的密度一均匀；也可能是电泳过程导致，注意正负极的金属丝是否是直的。
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