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标题:【分享】MTT大全

flower@@[使用道具]
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发表于 2015-8-12 09:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【分享】MTT大全


近期做MTT，看了很多帖子，结合自己的实验整理了一下，希望对战友有帮助！

MTT法测定细胞相对数和相对活力


一、原理
噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器
1）对数生长期细胞
2）受试因素（药物）
3）MTT：以PBS配制成5mg./ml，抽虑除菌，保存在4˚C
4）DMSO（二甲基亚砜）
5）96孔板
6）酶联免疫检测仪
7）细胞培养箱
三、实验步骤（实用于贴壁细胞）
1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理
所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题
1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。
3）贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入0.5%MTT，量为20ul/孔。
4）如果不使用96孔板，培养基超过100 ml，MTT按照10%的比例加入。
5）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。
6）对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。
7）96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。
8）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。
9）没有去掉上清直接加DMSO，沉淀会很难溶解。加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清。加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。
10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。
11）除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。
12）关于如何计算IC50 方法有多种
(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
(2)Bliss法:自己查阅书籍
(3) IC50计算软件，见下面附件
（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！
（5）在线求IC50或EC50：cuturl('http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm')
13）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.
五、参考内容
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2015-8-12 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问主任对数期生长的细胞的特点怎样？谢谢
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bring[使用道具]
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发表于 2015-8-12 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清”，可以不洗涤吗？我这没我这没有平板离心机，可以不离心吗？
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-8-12 09:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
洗涤是为了洗去细胞碎片，离心以避免吸去未贴壁细胞，可以不离心，主要看你的细胞状态好不好！
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发表于 2015-8-12 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
我想做对肿瘤细胞的杀伤实验，请问可不可以用MTT法，没有离心机，可以直接吸出液体吗后加DMSO吗？
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flower@@[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

当然可以，MTT简单，花费不高。最好还是离心，因为有些结晶紫会被吸出来，如果只是想看趋势倒是可以，最好多做几复孔，这样就有取舍了！
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发表于 2015-8-12 10:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢这么好的帖子。
昨晚加DMSO前把培养液吸出，吸出了很多结晶紫，导致每个组复孔之间的差异很大，但是没有平板离心机，怎么办呢？
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小明[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但是没有平板离心机，怎么办呢？
我也有同样的问题，请教了代教，可以放在小的epidolf管里，7000－8000/10－15min，然后吸取上清，然后直接加入DMSO,混合后再转到96孔板，操作时注意不要产生气泡，或者有容量的误差，就不准了。
不知道正确，有没有高手，给点意见。
我也正在用mtt，结果还行。
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发表于 2015-8-12 10:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做MTT时从来没有发现培养基里有MTT的结晶颗粒，但我们实验室用其他毒物做就有，所以我想这可能和所试毒物有关，供大家参考！
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tudou85[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
这一步培养液能不能换成PBS啊？？为什么一定要用1640这种培养基呢？
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