【求助】细胞免疫荧光

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标题:【求助】细胞免疫荧光

jude[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我目前正在做细胞免疫荧光,因为是第一次做,每一步都是摸索前进.第一次做出来的结果也不理想,希望各位有这方面心得的战友可否说明一下期间应该注意的问题呢?

箭头儿[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

免疫荧光第一步的步骤几注意事项
1.首先是玻片的处理:泡酸去污, 冲洗, 晾干, 泡纯酒精脱脂, 蒸馏水洗(此时要用镊子夹着洗), 晾干备用.
2.不知道你做的细胞是贴壁比较好的细胞比如干细胞,还是贴壁不大好的细胞比如神经元
前者的话可以不用多聚赖氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚赖氨酸以免洗片时细胞掉片
3. 固定,我用的是预冷纯丙酮固定15分钟(应为丙酮有毒,操作的时候小心些),这步应该注意:丙酮很容易挥发,但又要保证固定期间不能干片,所以要多滴加丙酮,其间用盖子盖住,这一步不要在6孔板内进行,因为丙酮会将其熔化.
4. 不知道你的一抗是在胞浆表达还是在胞核表达
如果在胞浆表达,可以不用0.01%的TRITON X-100渗透(我前几次用了TRITON,结果胞核也表现出很强的荧光), 当然,如果一抗是在胞核内表达要用TRITON 渗透15分钟
5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封闭,注意这一步不要洗,只是甩掉多余的封闭液.
6. 加一抗,根据你所做抗体的需求稀释,一般是先将稀释液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出来之前要离心10-20秒),一抗的量要多加些,也是为了避免干片.
7. 孵育抗体:最好是4度冰箱过夜,这个过夜不是简单的过夜,一般要达14-16个小时,此时要将6孔板做成湿盒,目的是妨干片.在孵育期间不要随意搬动,以免抗体流失.
注意,PBS液的PH值要调在7.4左右

箭头儿[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
免疫荧光第二步的步骤及注意事项
1. 等抗体孵育过后,取出洗片,这是要注意不要把不同抗体的片子混在一块了(比如冲洗玻片的吸头要一对一,冲完一种抗体后要去掉,换另一个再冲)
2. 洗后自然晾干,加荧光二抗(一般这也要摸个浓度,并不能按部就班地照着说明书上稀释),室温孵育45-60分钟,注意要避光,虽说荧光除非再紫外灯下才会淬灭的快,但操作时还是要注意避光
3. PBS洗,洗的时候还是要注意避光
4. 洗后自然晾干,加第二种荧光探针(我做的是一抗在胞浆表达,加第二种荧光谈针是染核,这样便于计数)孵育10-15分钟,避光条件下作用,洗片时也要避光.
5. 自然晾干后,50%缓冲甘油封片.

qhyu[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上的战友总结挺全面的，下面我结合自己实验心得将特别需要注意的事项再补充一下：
1，接种细胞密度很重要。不要过密或者过稀，这点很重要，直接决定你实验结果的好坏；
2，关于固定问题。楼上战友用预冷纯丙酮，而我使用4%的多聚甲醛，效果还是不错的，固定一般室温，时间10分钟就足够了；
3，清洗是个关键步骤。免疫染色涉及好多清晰的步骤，因此在清洗的时候一定要小心谨慎，防止细胞被冲掉或挤到一起的现象发生；
4，加荧光标记的二抗时一定要注意避光，防止荧光淬灭。而且在荧光显微镜观察的时候也要注意防止光线过强。

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发表于 2015-8-12 10:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

总之,首先,应该注意的是片子有没进行了脱脂处理;其二,注意洗片用PBS的PH植要在7.4左右;其三,固定,孵育一抗不能干片,孵育一抗时间要久;其四,多余的封闭液不能洗掉,只能甩干;其五,要注意避光
说了这么多,嘿嘿,最重要的一点是:你以后阐述问题的时候请具体一点,不要让回答问题的人遍地撒网,好累呀!!!

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发表于 2015-8-12 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上的各位都很有经验,佩服!
我也刚刚开始做荧光,做了一次,发现背景的荧光很强,要检测的荧光可以看到,但很弱,激
发一次拍照后几乎就没有,怎么回事儿?请高手指教!谢谢!

qianqin1977[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2015-8-12 10:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼上的各位都很有经验,佩服!
我也刚刚开始做荧光,做了一次,发现背景的荧光很强,要检测的荧光可以看到,但很弱,激
发一次拍照后几乎就没有,怎么回事儿?请高手指教!谢谢! ...

背景强，有可能 1玻片是否处理得当；2洗片没洗干净；3洗片用的PBS很脏；4抗体用前没有稍离心，离心过后取上清进行稀释；5用的荧光二抗浓度太高，并不是说坑体浓度高就会增强荧光，相反，会增加背景染色。还有就是二抗得质量问题。
抗体淬灭得太快有可能 1操作过程中未避光（可能性不是很大），2二抗稀释不当（太稀了），3 二抗质量存在问题，我第一次做得时候是用中山分装得进口FITC，结果也是荧光很弱，我同学做也一样，后来甚至用了很高得浓度都不行，没办法，换二抗，换了SIGMA公司（博士得公司分装)的Cy3，荧光很强，我们实验室的老师一看就感叹：“漂亮”。
你不妨试试，祝好运！

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发表于 2015-8-12 10:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问操作的时候怎么避光啊,没有光我怎么操作啊!!!

dior[使用道具]
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发表于 2015-8-12 10:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

提到的加一抗时要离心，是多少温度，多大转速离心十几秒？
还有抗体稀释液从哪里可以买得到？主要成分是什么？有没有含破膜剂？可不可以用含破膜剂的PBS代替？
还有，串色了，应该从哪些方面克服？
谢谢！
charles97 ：
关上门，拉上窗帘（最好是透一点光，不然不好操作的），我们是这样避光的。

箭头儿[使用道具]
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