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先天性卵巢发育不全综合征
目前滋养层细胞长势尚好！
一、液体配制
胰蛋白酶液（0.25%）
称取所需胰蛋白酶2.5g
加入无Ca2+、Mg2+液体（D-Hanks液）1000ml
磁力搅拌混匀，使其完全溶解
过滤、除菌、分装备用
D-Hanks液
准确称量NaCl 8.00g、KCl 0.40g、Na2HPO4.H2O 0.06g、KH2PO4 0.06g、NaHCO30.35g；
依次将各成分溶解于800ml三蒸水中。溶解时必须待一种试剂完全溶解后，再加入 下一种试剂，直至所有试剂溶解后混匀；
酚红用5.6%NaHCO3将之溶解；
补加水至1000ml混匀；
分装盐水瓶内，8磅10～20min高压蒸汽消毒灭菌，4℃冰箱内保存备用。
用水配制7.4% NaHCO3溶液，过滤除菌，分装备用；
用无菌NaHCO3溶液调节Hanks液pH值7.2～7.4。
以去离子水稀释DNA酶Ⅰ至200 u／ml,过滤除菌备用。
90%Percoll: (9份Percoll:1份9.0% NaCl)
DMEM-H-G:（DMEM培养液、25mM HEPES、25mM葡萄糖）
台盼蓝液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃冰箱内保存备用，使用时以PBS稀释至0.4%。
二、滋养层细胞分离纯化实验方法
取剖腹产术后的无菌胎盘组织，在无菌条件下剪取蜕膜层与羊膜层之间的绒毛组织，以无菌生理盐水反复洗涤三次，修剪以去掉连接的组织、血管等得到柔软的绒毛，大约30g。将绒毛组织剪碎至1～3mm3，并尽可能去除肉眼可见的小血管及纤维连接成分。
胰蛋白酶消化
将绒毛剪碎至2～3mm3左右的小块；
100mL 0.25%胰蛋白酶、15U/ml DNA酶Ⅰ37℃消化30min，每隔5～10min摇动一次；
（吹打）消化产物，（吸取消化液）经100目不锈钢筛网过滤后，滤液加入50ml离心管内（加入10%FCS），1000rpm/min离心5min，弃上清；
以含20％胎牛血清DMEM培养液重悬沉淀；（37℃孵箱中）
未消化组织重复消化两次；
收集三次细胞悬液，调整细胞浓度至1×106/ml（不必非常严格，只要不是过少），镜下检查细胞呈单个细胞分布。
此时可接种至培养瓶中培养，如果有细胞成活继续以下实验，便于分析原因。
Percoll等密度梯度沉降法分离得到纯滋养层细胞
制备密度梯度 用9.0%NaCl与Percoll以1：9混合，以达到生理性渗透压，再以0.9%NaCl稀释为45%和35%两个浓度，按浓度从大到小将两个不同密度的Percoll溶液逐层缓慢加入10ml离心管内，每个浓度3ml。
加样 用吸管吸取3ml细胞悬液（含4×107个细胞-----不必非常严格），小心加在10ml离心管顶层的分离介质上面。
分离 室温下以2500r/min离心20min
离心后分为3部分 底层为RBC、少量多形核WBC，顶层为组织连接成分、小血管、绒毛碎片，中层为相对一致的单个核细胞
收集 用吸管吸取云雾状的中层置于一50ml离心管内，DMEM稀释4倍，1000rpm/min离心10min，弃上清，以含20%胎牛血清、100u/ml庆大霉素、25mMol/L HEPES的高糖型DMEM培养液重悬沉淀。
细胞培养
将所得的细胞悬液浓度调整至5～6×105/ml，置于培养瓶或预先置有盖破片的六孔培养板内37℃，5%CO2孵箱内培养。每24h更换培养液1次。（第一次换液时用培养液洗两次，以去除细胞碎片、内源激素；换液之前在倒置相差显微镜下检查细胞贴壁和细胞形态。）
细胞活力检测（台盼蓝排斥试验）
制备单个细胞悬液，并作适当稀释（106细胞/ml）；
染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀；
计数：在3分钟内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。
结果：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下列公式计算细胞活力：
活细胞率（%）＝活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100
