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标题:【求助】质粒拷贝数计算法

fei1226com[使用道具]
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发表于 2015-8-31 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】质粒拷贝数计算法


质粒拷贝数如何计算？拷贝数的单位是多少？
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2015-8-31 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
质粒拷贝数的测定　
DH5α/pCW单菌落接种于5mlLB/Amp+,32℃振摇过夜,以相同OD600值按2%接种量转种于1mlLB/Amp+,32℃振摇至OD600约为0.6时加入50μl3H-TdR,继续于32℃振摇3h,6000r/min离心收集菌体细胞,用TSB溶液(50mmol/LTris-HCl,pH8.0,30mmol/LNaCl)洗涤菌体沉淀3次,加入100μl冰预冷的Sol (50mmol/LGlucose,25mmol/LTris-HCl,pH8.0,10mmol/LEDTA,pH8.0),混匀,避免剧烈振荡,加入200μlSol (0.2mol/LNaOH,1%SDS),颠倒混匀,冰上静置2min,加入150μlSol (3mmol/LK+,5mmol/LAc-),混匀后于冰上放置5min,12000r/min离心5min,将上清吸入另一个Ep-pendorf管中,作为含质粒DNA的部分;沉淀加入300μl溶解液(200mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA,1.5%SDS),Vortex剧烈振荡至溶液清亮,此为含菌体染色体DNA和蛋白的部分。分别将1/10体积的质粒部分和1/10体积染色体部分加入5ml闪烁液(100ml二甲基亚砜中含0.4gPPO和0.3gPOPOP)中,在液闪仪上计数,用以下公式计算质粒拷贝数:
N=(Me×Cp)/(Me×Ce)
N:质粒拷贝数;Me:E.coli染色体分子量,这里以平均染色体长4.0×103kb计算;Mp:质粒分子量;Cp:质粒Bq值;Ce:E.coli染色体Bq值。
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langlang[使用道具]
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发表于 2015-8-31 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没有这么麻烦吧。一般简略的计算拷贝数是用紫外分光光度计测质粒的浓度，再计算一下质粒的分子量（kd而不是bp）。测得的浓度除以分子量就是质粒的莫尔数了（如mol/ml），然后×阿伏加德罗常数就是拷贝数（个/ml）了。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2015-8-31 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我测的质粒浓度是179.6ｕｇ／ｍｌ，测得的浓度除以分子量，然后×阿伏加德罗常数（6.02*10＾23），是不是还得乘以10-6才是拷贝数（个/ml）了。拷贝数有用（个／ｕｌ）计算的吗？两者有什么差别？
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2015-8-31 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

179.6/1000000=1.796*10^-4 g/ml
(1.796*10^-4)/mw*(6.02*10＾23)=N （个质粒/ml）
N*1000=1000N （个质粒/ul）
取1ul，就等于取了1000N个质粒。
不知道这样能不能看懂？
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luoliqiong[使用道具]
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发表于 2015-8-31 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做荧光定量上标准品时，是用个/ul，还是用个/ml ?
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2015-8-31 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚刚开始作实时荧光pcr，作了3个浓度107，106，105。反应条件设为95度5分钟，95度30秒，60度1分种，72度1分种。质粒1.0ｕｌ，10*ｂｕｆｆｅｒ　5ｕｌ　，ｄｎｔｐ4ｕｌ，引物2ｕｌ，探针1ｕｌ，酶0.5ｕｌ，水36ｕｌ共50ｕｌ体系做REAL-TIME．40循环。扩增曲线从2循环就开始了，分析之后 就没有曲线了，产物电泳之后看到目的片断，这是怎么回事，是探针有问题吗？帮忙看看吧，谢谢！
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zhezhe[使用道具]
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 小中大

“作了3个浓度107，106，105”什么意思？稀释倍数吗？
可能的原因是你的模板浓度太大了，建议你将模板十倍稀释，一直稀释到理论上是0个质粒为止，以后就知道选择哪个稀释倍数来做标准曲线比较好了。
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fei1226com[使用道具]
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 小中大

我是将模板十倍稀释的，现在的问题是我把10＾７，10＾6，10＾5，10＾4，10＾3，10＾2，10＾0都做real-time pcr,每个浓度都是扩增曲线从2循环就开始了，分析之后 就没有曲线了，产物电泳之后都能看到目的片断，不知道是怎么回事？我的模板原始拷贝数是5.3*10＾10／ｕｌ，我是用双蒸水稀释的，有影响吗？如果是质粒浓度大，下一步该如何稀释呢？
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