【求助】实时荧光定量PCR污染问题

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标题:【求助】实时荧光定量PCR污染问题

birdfish[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小弟最近一直在做实事荧光定量pcr,但是有一个问题老是困扰我，每次实验都是阴性对照在34个循环之后也出现荧光信号，换了探针、引物都不好使，本人自从第一次污染后特别重视，预混试剂都是在安全柜中进行，每次实验则必定要用去不上一次性手套，但还是没有幸免于难。
想问的是针对现有的污染应该怎么处理，Dnase法可以吗，探针、引物不会受到影响吗？
在线等，急！！！

079777chao[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

污染是定量pcr的天敌，你不妨试试找新的没有稀释的引物和探针，用绝对保证无污染的灭菌水去稀释分装好，建议你用别的实验室不会存在你的模板的地方的水稀释，然后分装。把所有的试剂都换新的，试一下。
如果你的模板是反转录的cDNA，那你提取RNA和反转录的试剂也要换,最好用新处理好的EP管和枪头。做pcr和模板提取的地方要分开。

birdfish[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵我是直接提DNA做的，污染更麻烦了，所有东西都是放在一起的，这个可能是致命原因，另外我咨询了转基因检测中心的老师，我现在按照他们的管理方法来处理我的实验室，现在污染是随机的了，如9个阴性对照其中一个是假阳性

abc816[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

引物浓度考虑了吗？

阿福[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

啊！我的实验也是，阴性对照在33～35起来了，之前的也是一条曲线，而不是一条直线

birdfish[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由阿福于 2015-9-1 10:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
啊！我的实验也是，阴性对照在33～35起来了，之前的也是一条曲线，而不是一条直线

呵呵应该考虑引物和探针是否污染了。你的是在33-35起来了，应该说浓度还是挺高的，把没污染的引物和探针稀释后，小量分装，每次用完就直接报废吧，不要再次使用，水也是。勤换手套，移液器最好是两套，一套用来预混试剂，一套用来加样品，这样也能杜绝移液器的污染了。
你是随机污染呢还是所有阴性都出现上扬了?

zhezhe[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得不一定是污染的问题
如果你是用的探针,污染的可能性会高一些,应该注意试剂和操作方式,有些人可能某些固定的操作习惯会造成污染.
如果是用的染料,建议跑个胶看看,有可能是非特异性扩增或者引物二聚体造成的.
不管怎么样,建议先跑个胶看一下,是否有目的条带扩增再作决定.

birdfish[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 zhezhe 于 2015-9-1 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我觉得不一定是污染的问题
如果你是用的探针,污染的可能性会高一些,应该注意试剂和操作方式,有些人可能某些固定的操作习惯会造成污染.
如果是用的染料,建议跑个胶看看,有可能是非特异性扩增或者引物二聚体造成的.
...

用的是探针，跑电泳看了，就是污染了，但是也不知道怎么污染的，大虾有什么好的建议吗？

seagate[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有可能是移液枪的问题

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2015-9-1 10:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有时候污染可能是存在于空气中的，污染物在空气中形成气溶胶是很难去除的。

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