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标题:【求助】PCR产物电泳条带为什么被“劈开”了？

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发表于 2015-9-1 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR产物电泳条带为什么被“劈开”了？

向各位老师请教：PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳的结果如图。电泳条件：100mV，30min
marker大小分别是100，200，…600bp
预期的PCR产物条带大小是488bp，不知道为什么出现了两条距离很接近的条带，个人感觉不像是引物二聚体。请各位老师帮忙分析分析原因，谢谢！


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发表于 2015-9-1 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

奇怪的是，当把这种PCR产物进行酶切，再电泳时，却没有出现这种现象，条带都很清晰而完整。见下图


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发表于 2015-9-1 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种情况我在扩增actin的时候遇到过，当时我做半定量，但是内参和目的循环数不同，所以我在25个循环是拿出actin管子，跑胶就出现了和你类似的情况，我当时分析是因为没有进行后续的72度8min这一步，导致有些扩增产物没在尾端加上一些polyT，从而小了几十个bp，但是显然不适用你这种情况，有别的同志也遇到过这种奇怪的现象吗？都提出来探讨下，说说可能性吧。
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发表于 2015-9-1 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

嗯，我们没有省略延伸的步骤。
但是分离的DNA似乎放的有点久了，会不会跟这个有关系呢？
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发表于 2015-9-1 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在小木虫发的帖子有站友说是胶做的有问题，上下浓度不一致，所以出现了两条带。如果是这样的话，为什么酶切产物看不出问题呢？两者用的是同一批凝胶。
另外我个人猜想这种情况下（表层和底层之间出现了密度梯度）条带是不是应该拉的比较长，而不是分为两条？
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发表于 2015-9-1 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也觉得不应该是胶滴问题，DNA放久似乎也不可能。
问下，你扩增的是cDNA产物吗？如果是，有可能你的cDNA体系里面混有痕量的基因组DNA，这样会导致扩增出两条带的情况。比如，这两者中间刚好就隔了个20-30bp的内含子么。
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发表于 2015-9-1 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的模板不是cDNA.今天查了查，这种现象好像叫做“ghost band”，在western blot和微卫星序列的PCR中比较常见，不过机制可能与我们这个不同。我们的实验是做单核苷酸多态性SNP的。
还有个师姐说可能是扩增产物自己形成了环。在网上说的，说的不是很清楚。有机会再问问她。
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 小中大

扩增产物自己形成了环
这个有点意思哦，难不成是扩增产物自身形成了某种稳定的2级结构吗？产物还是一样的产物，但是由于有空间构象的不同，从而导致跑胶时出现这样几十个bp的微小差异，这样倒是有可能解释你说的这种现象哦！有达人能给出科学点的解释吗？
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发表于 2015-9-1 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这种现像很像是用不对称对引物扩增导致,跑得快一些的是单链,后面的是双链,当酶切时,双链切断,单链仍在
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 小中大
这种情况我在扩增actin的时候遇到过，当时我做半定量，但是内参和目的循环数不同，所以我在25个循环是拿出actin管子，跑胶就出现了和你类似的情况，我当时分析是因为没有进行后续的72度8min这一步，导致有些扩增产物没在尾端加上一些polyT，从而小了几十个bp，但是显然不适用你这种情况，有别的同志也遇到过这种奇怪的现象吗？都提出来探讨下，说说可能性吧。

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72度停留5－10分钟，竟然可以延伸出polyT，而且还有几十个之多，我以前没有见过相关的资料，不知如何得到的这样的结论的？
一般的资料显示，停留这步主要还是保证产物的完整性，另外还会加A（TA克隆的依据）。环化的可能也不大，没有结构的基础！！楼上的解释可能更接近事实！
另 楼主是否可以将详细的实验细节说明下，比如用的什么模板，引物，PCR的步骤等！
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