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标题:关于RT-PCR

兔two[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于RT-PCR

关于RT-PCR [转载]

宝公司的一步法RT-PCR（AMV)，试剂盒里提供的control60度能做出来。用内参做时，60度时出现弥散状条带，而55度时什么也没有。做自己的样品，退火温度为45、50、60度时均出现弥散状条带。因为试剂盒提供的反应次数有限，所以想用尽量少的对照找出问题，望指点！
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发表于 2011-9-15 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
王婆买瓜，自吹自夸。任何公司为了显示其产品的优良性能，都会弄一个control 当作外衣。但这个control肯定是其千里挑一得到的。所以，其control肯定是能轻易而举的搞掂。但等你把东西买回家，用在自己身上时，问题也就来了。就想商店里的模特，穿什么衣服都好看，可你穿上呢？

我看你的问题不一定出在PCR的退火上。你在RT时，温度是多少？48度？如果你的基因GC含量不高，42度就足以。再者，出现smear，配胶时是否完全熔化？  
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发表于 2011-9-15 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，你的引物提供的Tm值是多少，你可以将退火温度定为Tm值以下5度左右。其次造成PCR非特异性带增多的原因很多，如酶浓度过高，循环次数过多，镁离子浓度不恰当，引物浓度过高，4种dNTP浓度不平衡也可造成非特异性带增多。另外你还可试用一下高温启动以减少非特异带的产生。
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冰激凌小姐[使用道具]
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 小中大
我做PCR时,目的带又粗不够亮,100bp以下还有一模糊杂带,咋处理比较好?
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发表于 2011-9-15 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做PCR时,目的带又粗不够亮,100bp以下还有一模糊杂带,咋处理比较好?

====================

首先降低循环周数，
然后微调退火温度和时间。

注意胶是否有问题？
前几天刚见识假的琼脂糖，
挺好的产物跑出来就不对。
就是模模糊糊的。
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发表于 2011-9-15 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先应该保证RNA的质量很好
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢eeflying与oasisge两位高手指点.我把循环次数由40减为35,温度上调0.5度,似乎见效不大.另外还有一个趋势是镁浓度高(1.8)时目的带和杂带均亮,镁低(1.2)时均暗.为什么他们会同暗同亮?应该相互间有竞争性呀.
      还有听各位高手屡次提热启动的事,我遂在变性后加taq酶,发现一新问题,石蜡油在一开始就加还是此时加了酶再加?  
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发表于 2011-9-15 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢eeflying与oasisge两位高手指点.我把循环次数由40减为35,温度上调0.5度,似乎见效不大.另外还有一个趋势是镁浓度高(1.8)时目的带和杂带均亮,镁低(1.2)时均暗.为什么他们会同暗同亮?应该相互间有竞争性呀.
      还有听各位高手屡次提热启动的事,我遂在变性后加taq酶,发现一新问题,石蜡油在一开始就加还是此时加了酶再加?

===============================================================================================

      加Mg++是使酶的活性增加，也就是说酶跑得快了。当然是特异和非特异都会同比例增加。

      热启动不是你那样加的，在PCR仪加热到90C以上在把管加到PCR仪中就可以了，变性后加Taq 酶的方法其实不可取。  
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发表于 2011-9-15 12:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那个100bp的可能就是引物二聚体，试着把引物浓度降低！  
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韩梅梅[使用道具]
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 小中大
mrna质量过关，就容易，否则很多建议只能让你白费钱，又白辛苦，找个好方法检RNA的质量，才是上策。
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