求助PCR引物情况

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 求助PCR引物情况

31 1/4 1 2 3 4 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:求助PCR引物情况

#甜#[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72838
精华 0
积分 300
帖子 319
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2011-9-15 12:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

求助PCR引物情况 [转载]

朋友设计了两对引物做RT-PCR，PCR条件摸索了好长时间，退火温度也基本都试过了，仍然没有结果，目前怀疑引物设计可能有问题，请那位高手出马帮忙给分析一下，下面是其中的一对引物：
R1：antisense:5－CAT TCC GCT TTT GTT CAT TTG G－3
   sense: 5－GAA GCT CCT GGA TTT CCT CAT CA－3
mRNA序列： 1 ctctgacctg agaccaatag ctgtgtctac ccggactcag cgtccagctc accgccacta
   61 acgcgccgcg cattggacac ctgatccaca caccttcggg caccagtgaa aaaccgcgac
   121 ttgattttct ggaagaacgc ccccagggtg tgggagcggt cgtggaggac cagcaggagg
   181 aagcggaggg gagaggggca gtagtggagg cagagaaagc gttgaaccag ctgtgttggc
   241 cgaaggcacg aaacggcaaa aggcagcggt gagcatctgt gtggttcccg ctgggaacct
   301 gcaggcagga ccggcgtggg aacgtggctg gcccgcggtg gaccgcgtct tcgccacaat
   361 ggtccggctc ctcttgattt tcttcccaat gatctttttg gagatgtcca ttttgcccag
   421 gatgcctgac agaaaagtat tgctggcagg tgcctcgtcc cagcgctccg tggcgagaat
   481 ggacggagat gtcatcatcg gagccctctt ctcagtccat caccagcctc cagccgagaa
   541 ggtacccgaa aggaagtgtg gggagatcag ggaacagtat ggtatccaga gggtggaggc
   601 catgttccac acgttggata agattaacgc ggacccggtg ctcctgccca acatcactct
   661 gggcagtgag atccgggact cctgctggca ctcttcagtg gctctcgaac agagcatcga
   721 attcatcaga gactccctga tttccatccg agatgagaag gatgggctga accgatgcct
   781 gcctgatggc cagaccctgc cccctggcag gactaagaag cctattgctg gagtgatcgg
   841 ccctggctcc agctctgtgg ccattcaagt ccagaatctt ctccagctgt tcgacatccc
   901 acagatcgcc tattctgcca caagcataga cctgagtgac aaaactttgt acaaatactt
   961 cctgagggtg gtcccttctg acactttgca ggcaagggcg atgctcgaca tagtcaagcg
   1021 ttacaactgg acctatgtct cagcagtcca cacagaaggg aattacggcg agagtggaat
   1081 ggatgctttc aaagaactgg ctgcccagga aggcctctgc atcgcacact cggacaaaat
   1141 ctacagcaat gctggcgaga agagctttga ccggctcctg cgtaaactcc gggagcggct
   1201 tcccaaggcc agggttgtgg tctgcttctg cgagggcatg acagtgcggg gcttactgag
   1261 tgccatgcgc cgcctgggcg tcgtgggcga gttctcactc attggaagtg atggatgggc
   1321 agacagagat gaagtcatcg aaggctatga ggtggaagcc aacggaggga tcacaataaa
   1381 gcttcagtct ccagaggtca ggtcatttga tgactacttc ctgaagctga ggctggacac

#甜#[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72838
精华 0
积分 300
帖子 319
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2011-9-15 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1441 caacacaagg aatccttggt tccctgagtt ctggcaacat cgcttccagt gtcgcctacc
   1501 tggacacctc ttggaaaacc ccaactttaa gaaagtgtgc acaggaaatg aaagcttgga
   1561 agaaaactat gtccaggaca gcaaaatggg atttgtcatc aatgccatct atgccatggc
   1621 acatgggctg cagaacatgc accatgctct gtgtcccggc catgtgggcc tgtgtgatgc
   1681 tatgaaaccc attgatggca ggaagctcct ggatttcctc atcaaatcct cttttgtcgg
   1741 agtgtctgga gaggaggtgt ggttcgatga gaagggggat gctcccggaa ggtatgacat
   1801 tatgaatctg cagtacacag aagctaatcg ctatgactat gtccacgtgg ggacctggca
   1861 tgaaggagtg ctgaatattg atgattacaa aatccaaatg aacaaaagcg gaatggtacg
   1921 atctgtgtgc agtgagcctt gcttaaaggg tcagattaag gtcatacgga aaggagaagt
   1981 gagctgctgc tggatctgca cggcctgcaa agagaatgag tttgtgcagg acgagttcac
   2041 ctgcagagcc tgtgacctgg ggtggtggcc caacgcagag ctcacaggct gtgagcccat
   2101 tcctgtccgt tatcttgagt ggagtgacat agaatctatc atagccatcg ccttttcttg
   2161 cctgggcatc ctcgtgacgc tgtttgtcac cctcatcttc gttctgtacc gggacacacc
   2221 cgtggtcaaa tcctccagta gggagctctg ctatatcatt ctggctggta ttttcctcgg
   2281 ctatgtgtgc cctttcaccc tcatcgccaa acctactacc acatcctgct acctccagcg
   2341 cctcctagtt ggcctctctt ctgccatgtg ctactctgct ttagtgacca aaaccaatcg
   2401 tattgcacgc atcctggctg gcagcaagaa gaagatctgc acccggaagc ccagattcat
   2461 gagcgcttgg gcccaagtga tcatagcctc cattctgatt agtgtacagc taacactagt
   2521 ggtgaccttg atcatcatgg agcctcccat gcccattttg tcctacccga gtatcaagga
   2581 agtctacctt atctgcaata ccagcaacct gggtgtagtg gcccctgtgg gttacaatgg
   2641 actcctcatc atgagctgta cctactatgc cttcaagacc cgcaacgtgc cggccaactt
   2701 caatgaggct aaatacatcg ccttcaccat gtacactacc tgcatcatct ggctggcttt
   2761 cgttcccatt tactttggga gcaactacaa gatcatcact acctgcttcg cggtgagcct
   2821 cagtgtgacg gtggccctgg ggtgcatgtt tactccgaag atgtacatca tcattgccaa
   2881 acctgagagg aacgtccgca gtgccttcac gacctctgat gttgtccgca tgcacgtcgg
   2941 tgatggcaaa ctgccgtgcc gctccaacac cttcctcaac attttccgga gaaagaagcc
   3001 cggggcaggg aatgccaatt ctaacggcaa gtctgtgtca tggtctgaac caggtggaag

#甜#[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72838
精华 0
积分 300
帖子 319
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2011-9-15 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3061 acaggcgccc aagggacagc acgtgtggca gcgcctctct gtgcacgtga agaccaacga
   3121 gacggcctgt aaccaaacag ccgtaatcaa acccctcact aaaagttacc aaggctctgg
   3181 caagagcctg accttttcag atgccagcac caagaccctt tacaatgtgg aagaagagga
   3241 caatacccct tctgctcact tcagccctcc cagcagccct tctatggtgg tgcaccgacg
   3301 cgggccaccc gtggccacca caccacctct gccaccccat ctgaccgcag aagagacccc
   3361 cctgttcctg gctgattccg tcatccccaa gggcttgcct cctcctctcc cgcagcagca
   3421 gccacagcag ccgccccctc agcagccccc gcagcagccc aagtccctga tggaccagct
   3481 gcaaggcgta gtcaccaact tcggttcggg gattccagat ttccatgcgg tgctggcagg
   3541 cccggggaca ccaggaaaca gcctgcgctc tctgtacccg cccccgcctc cgccgcaaca
   3601 cctgcagatg ctgcccctgc acctgagcac cttccaggag gagtccatct cccctcctgg
   3661 ggaggacatc gatgatgaca gtgagagatt caagctcctg caggagttcg tgtacgagcg
   3721 cgaagggaac accgaagaag atgaattgga agaggaggag gacctgccca cagccagcaa
   3781 gctgacccct gaggattctc ctgccctgac gcctccttct cctttccgag attccgtggc
   3841 ctctggcagc tcagtgccca gttcccccgt atctgagtcg gtcctctgca cccctccaaa
   3901 tgtgacctac gcctctgtca ttctgaggga ctacaagcaa agctcttcca ccctgtagtg
   3961 tgtgtgtgtg tgtggggggg ggggggagtg cgcatggaga agccagagat gccaaggagt
   4021 gtcaaccctt ccagaaatgt gtagaaagca gggtgaggga tggggatgga ggaccacggt
   4081 ctgcagggaa gaaaaaaaaa atgctgcggc tgccttaaag aaggagaggg acgatgccaa
   4141 ctgaacagtg gtcctggcca ggattgtgac tcttgaatta ttcaaaaacc ttctctagaa
   4201 agaaagggaa ttatgacaaa gcacaattcc atatggtatg taacttttat cgaaaaaaat
   4261 aataaaacgt aaaaataaaa tc

韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态离线

发表于 2011-9-15 12:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分析结果如下：我觉得设计挺好，虽有不足，但不应该影响大局，你的内参扩的如何？？
１。一般情况：
--------------------------------------------------------------------------------
Selected Primers
--------------------------------------------------------------------------------
New:1702U23 Upper Primer
5' GAA GCT CCT GGA TTT CCT CAT CA 3'
Length: 23-mer
5' 1702
Tm: 69.6 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -42.8 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 417/418
1/E: 4.69 nmol/A260
33.1 µg/A260
New:1894L22 Lower Primer
5' CAT TCC GCT TTT GTT CAT TTG G 3'
Length: 22-mer
3' 1894
Tm: 69.6 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -42.9 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 473/473
1/E: 5.20 nmol/A260
35.1 µg/A260

２。3'二聚体
uper : - 1.9 lower: -3.1 uper/loer: 1.9

3. 3'发夹结构：
uper: X lower: X

4: PCR:

Optimal Annealing Temperature: 55.4° (Max: 72.0°)
--------------------------------------------------------------------
Position Length Tm [°C] GC [%] P.E.#
--------------------------------------------------------------------

韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态离线

发表于 2011-9-15 12:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Product ----- 214 84.0 46.3 46.3
Upper Primer 1702 23 72.3 47.8 417/418
Lower Primer 1894 22 72.0 40.9 473/473
--------------------------------------------------------------------
Product Tm - Lower Primer Tm: 12.0
Primers Tm difference: 0.3
----------------------------------
Concentration
----------------------------------
Upper Primer 200.0 nM
Lower Primer 200.0 nM
Monovalent Cation 50.0 mM
Free Mg[2+] 0.7 mM
----------------------------------
Total Na[+] Equivalent: 155.8

5.内部稳定性

附件

2011-9-15 12:30

112176-luke-embed.jpg (21.74 KB)

#甜#[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72838
精华 0
积分 300
帖子 319
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2011-9-15 12:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常非常感谢你的帮助，看的出来你是个行家。我的内参扩的挺好，用的倍他actin，退火温度58度。按照你的分析，我按照这对引物能扩出来？退火温度在55度附近还是在70度附近？还请继续指点。

韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态离线

发表于 2011-9-15 12:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

55C退货，所有时间都确定在20sec左右

#甜#[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72838
精华 0
积分 300
帖子 319
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2011-9-15 12:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再请教您一个问题：是所有时间（循环中的变性时间、退火时间、延伸时间）均为20″吗？我按这个方案做了，结果目的条带不够亮，杂带（约400余bp）比marker还亮。

韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态离线

发表于 2011-9-15 12:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

提高退火温度，。热启动。

请详细说明你的体系情况和使用的酶的情况。和PCR电泳图。

#甜#[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 72838
精华 0
积分 300
帖子 319
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态离线

发表于 2011-9-15 12:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

敬请指点：我设置了五个温度，53\56\57\59\61度，55\57均有三条带，两条又细又亮的是杂带，目的基因片断模糊。我的体系25ul,为：
H2O 16ul
10*Buffer 2.5ul
Mgcl2 1.5ul
P1 1ul
P2 1ul
dNTP 0.5ul
Taq 0.5ul
cDNA 2ul
石腊油 20ul
两步法，pcr循环为：95,4min;95,35sec 退火温度35sec 72,15或25或35sec均试过，35循环；72,7分钟；4,保存
怎么办？

31 1/4 1 2 3 4 ››