【求助】细胞株稳定性测试-加压与否

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标题:【求助】细胞株稳定性测试-加压与否

mamamiya[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，
有个小问题，CHO细胞株稳定性测试的时候，加不加MTX/MSX，由官方的说法吗？
有人说不能加压，加压就不能准确描述细胞的“稳定性”了。
也太有人说，可以加压，因为不加压表达量都会降低，通常是很难找到一个不加压就稳定表达的细胞株。
不知道大家一般怎么确定的？谢谢

jude[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

之前有过类似的讨论：
[求助]请问生产用动物细胞的传代稳定性实验是怎样的？ - 丁香园论坛
里面有篇文献，我看了下是加了低剂量的MSX做稳定性试验的。
几个相关的国内指导原则也没有明确一定不能加压。
总的来说，我认为能不加就不加，加了CDE应该也认纯属个人意见

whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

两个都做，对比进行看看，如果不加，产量下降在可接受范围内，也没关系，例如是初始代次产量的80%或者70%。
在发酵或者细胞培养阶段是不能含抗生素的，我感觉传代稳定性试验是在不含抗生素的培养基中进行的。

mamamiya[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感谢两位的回复。
国内外的指导原则都比较笼统，没有详细说明稳定性检测的步骤。
据我目前了解，国内不少企业都还是加压进行测试的，只要表达量下降在30%之内都可以接受。

ssonglikihi[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你说的传代稳定性是倍增代次还是传一次算一次。
之前和国外一个负责注册的交流的，我们是按照倍增generation number来计算的，不是passage number。
我们大肠杆菌、酵母类菌株、细胞项目是加压和不加压两个都做的，但是一般以不加压力的为准，加压的起对照作用。
对于大肠和酵母来说，不加压，倍增60代次产量或者基因丢失不严重，维持90%以上问题不大。
对于细胞项目来说，经验不多，不加压的，倍增60代次产量会下降，一般要到原始细胞的60-80%。

ha111[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

稳定性测试就是看细胞株实际用于生产过程中的表达量和产品质量是否符合要求，模拟实际生产过程的培养条件，然后进行培养代次和时间延长是不是更加科学？

baidukk[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如何加压？

veiwu[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目前比较稳定的筛选系统是GS筛选系统，在不加压的情况下连续传代两个月后表达量可能会维持在初始的70%左右，如果是DHFR筛选系统，就很难了。
还有其他抗性筛选的标记的就更不稳定了，之前做过Zeocin抗性和G418抗性的稳定细胞株。不加压培养一个月表达量就下降50%以上。

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发表于 2015-9-8 14:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 veiwu 于 2015-9-8 14:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

目前比较稳定的筛选系统是GS筛选系统，在不加压的情况下连续传代两个月后表达量可能会维持在初始的70%左右，如果是DHFR筛选系统，就很难了。
还有其他抗性筛选的标记的就更不稳定了，之前做过Zeocin抗性和G418抗性的稳定细 ...

你描述的是自己的项目经验吗？
之前在IBC会议上听到的和你说的正好不一致，杨建国博士讲的，我也专门查过一篇综述文献，现在找不到了。
说的是GS系统，基因更容易丢失，容易出现表达量下降情况，后来的GS敲除细胞中专门也强调这样更利于基因稳定。说DHFR系统的表达比较稳定，基因丢失不严重。
还有关注个一篇关于细胞传代稳定性的文章提到，表达量下降是由于基因插入位点调控序列的甲基化导致的，基因拷贝数没发生变化。
我感觉每个项目都不一样，每个克隆也不一样，不一定是筛选系统的问题。

生物迷[使用道具]
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发表于 2015-9-8 14:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 baidukk 于 2015-9-8 14:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如何加压？

加压指的是”加不加筛选剂“，GS系统 MSX，DHFR系统加MTX，还有Neo系统加G418。

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