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标题:筒子们帮帮我~

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发表于 2011-9-15 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

筒子们帮帮我~

筒子们帮帮我~[转载]


我想请教一个问题，我现在请公司合成了两条核酸单链，每条是78个碱基，是设计好互补的，我想在PCR仪中将这两条链黏成一条双链，但我不知道应该如何设置这个程序，请各位师兄师姐帮帮我。
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发表于 2011-9-15 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两条链等摩尔溶于TE,浓度体积以你后续试验目的为准，但浓度宜小不宜大，
如果两条链完全互补，只想退火，找个大点的水浴，加热到95度（就是沸水也没关系），把你的样本放进去，自然冷却到室温。要用PCR仪作斜坡温度设置在5分钟以上。

如果两条链末端互补，想退火后互为引物作末端延伸，按PCR的体系配，只是不加引物，循环５圈，三个时间均要设为１０sec就可以了,退火温度按末端16bp碱基计算。
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发表于 2011-9-15 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢，但我不明白“用PCR仪作斜坡温度设置在5分钟以上 ”是什么意思，如何做。
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 小中大
非常感谢，但我不明白“用PCR仪作斜坡温度设置在5分钟以上 ”是什么意思，如何做。
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发表于 2011-9-15 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多数PCR已可以设定从一个温度到另一个温度要求经历的过程，我们称为斜坡，
这个过程的时程，我们称斜坡时间，但大家习惯称温斜坡温度，这个温度是时间，而不是一个温度

比如初始温度99C 2min

目的温度4C forever

斜坡温度要求15min,

则PCR仪会在正好15min的时间内均匀降温的，降温速度为-0.1C/sec。

我们做PCR希望斜坡温度为0sec,变化速度为无穷大，但实际根本做不到

PE9600为1C/sec,罗氏的毛细管PCR仪就很快，

设计PCR参数时，斜坡对于PCR的影响是最难掌握的，因为在斜坡过程中Taq酶的活动是不规律的，它介于两种状态之间，其实非特异产物的形成，也都是在斜坡中形成，在后续反应中放大的。在PCR过程中，最危险的斜坡发生在PCR开始前的过程即从室温到95C的过程，因为它的非特异产物最多，而放大规模也最大，因此，热启动是很好的习惯，有时会成为PCR成功的关键。

离题了，呵呵……………………
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发表于 2011-9-15 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们的PCR仪好象没有斜坡温度设置，所以我把程序设为 T=95 C time=5分，T=90 C time=5分依此类推， 每次降5度，每个温度段5分钟，直到37 C，TIME=10分，然后我取出2ul跑电泳，结果发现跑成两个条带，请问eeflying 兄，这说明什麽？是代表反应还不充分，既有单链，又有双链吗？急急请指教
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 小中大
我们的PCR仪好象没有斜坡温度设置，所以我把程序设为 T=95 C time=5分，T=90 C time=5分依此类推， 每次降5度，每个温度段5分钟，直到37 C，TIME=10分，然后我取出2ul跑电泳，结果发现跑成两个条带，请问eeflying 兄，这说明什麽？是代表反应还不充分，既有单链，又有双链吗？急急请指教
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发表于 2011-9-15 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不是,可能你序列本身有单链内部互补,自身折返,或两条链之间在不对等位置也有互补,

请问一下,78bp你怎么跑的两条带？
琼脂糖胶吗？
多大？
这要是能分出来，真是太佩服了。

不行，就用大烧杯试试，实际更方便。

还有，请问你后续试验是什么？
如果是PCR或者酶切的话，这可能已经足够。
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发表于 2011-9-15 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对不起，我没说清楚，我用的是2.0%的琼脂糖凝胶，电压是80伏。但确实是两条带，我不知道为什麽，你说用大烧杯试试，如何试呢？另外，我的后续试验是将这条双链与带有目的基因的质粒连接，然后表达融合蛋白。你说这可以吗？


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 小中大
两条链等摩尔溶于TE,浓度体积以你后续试验目的为准，但浓度宜小不宜大，
如果两条链完全互补，只想退火，找个大点的水浴，加热到95度（就是沸水也没关系），把你的样本放进去，自然冷却到室温。

出来结果不一定完全没有意外带，但已经足够，

建议再合成引物，把你合的寡链再扩一下，因为合成的毕竟少，而你这么短的链纯化效率又偏低，可能不够用，不如PCR一下，把你合的链作模板扩增一下，也禁得糟践，对吧。

呵呵～～～～～～～～～～

作PCR时，像你这种情况，所有温度照传统设置，所有时间都改成1sec，整个PCR有20分钟就完了，很方便的。
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