PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 求助：PCR总不见产物

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 20  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:求助：PCR总不见产物

紫圃[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72875
精华 0
积分 129
帖子 38
信誉分 100
可用分 886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
1

发表于 2011-9-15 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：PCR总不见产物

求助：PCR总不见产物 [转载]


模板是基因组DNA，目的片段1100bp，引物、dNTP等都是上海生工的，
提供的Tm为52和55，50ul体系，标准PCR，94℃5min预变性，可是从50℃～56℃，用Mg2+2.5mM，电泳常见不到扩增产物，很不稳定。是不是产量太低了？
怎样提高产量呢？
顶部
韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
2

发表于 2011-9-15 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参怎么样呢？
酶有没有问题？
生工的东西不敢恭维。
顶部
阿福[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 69991
精华 0
积分 269
帖子 277
信誉分 100
可用分 2146
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
3

发表于 2011-9-15 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
TM低，引物长度没问题吧？
顶部
紫圃[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72875
精华 0
积分 129
帖子 38
信誉分 100
可用分 886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
4

发表于 2011-9-15 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有设内参
Tag酶是好的，其他的PCR可以的

有没可能是Buffer的PH值的影响啊？
顶部
紫圃[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72875
精华 0
积分 129
帖子 38
信誉分 100
可用分 886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
5

发表于 2011-9-15 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有设内参
Tag酶是好的，其他的PCR可以的

有没可能是Buffer的PH值的影响啊？
顶部
椰子叶子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70440
精华 0
积分 270
帖子 300
信誉分 100
可用分 2226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
6

发表于 2011-9-15 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以先用低的退火温度如５０，试一试，可能有。也可以先用４０几度退火，５循环，再用正常退火温度，35循环。
祝你好运。
顶部
韩梅梅[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72223
精华 1
积分 353
帖子 382
信誉分 102
可用分 2701
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-6
状态 离线
7

发表于 2011-9-15 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先用10ul或20ul体系扩增，摸一下条件。不要直接就用50ul体系去扩——太浪费了！
等条件稳定了再扩大体系做。
顶部
#甜#[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72838
精华 0
积分 300
帖子 319
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
8

发表于 2011-9-15 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物的特异性BLAST过吗？我觉得你的扩增片断较长，需要调整镁离子梯度确定。而且，还要有耐性，退火温度2度为调整梯度。送你5个字：事事难预料！  
顶部
紫圃[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 72875
精华 0
积分 129
帖子 38
信誉分 100
可用分 886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
9

发表于 2011-9-15 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家帮忙！
我试着用βG为内参，48℃4个循环，再50℃30循环，Taq酶是预变性后加的。Mg2+还是2.5mM。结果，跑出7个条带，其中βG最亮，而目标条带1100bp的隐约可见，最淡。
我打算从56℃、54℃、52℃各2个循环，再50℃30循环。可行吗
顶部
阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
10

发表于 2011-9-15 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家帮忙！
我试着用βG为内参，48℃4个循环，再50℃30循环，Taq酶是预变性后加的。Mg2+还是2.5mM。结果，跑出7个条带，其中βG最亮，而目标条带1100bp的隐约可见，最淡。
我打算从56℃、54℃、52℃各2个循环，再50℃30循环。可行吗？

==========================================================================================================

你可以用得到的PCR产物为摸板，做次级扩增。
我觉得你的问题本来就是PCR产量低，还在体系里面加上一个内参，那样的话，内参和你的目的片段竞争扩增，会导致目的片段的产量更低。
顶部
 20  1/2 12››