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标题:请教各位高手,SYBR Green I 会不会干扰PCR反应?

缘yuan[使用道具]
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请教各位高手,SYBR Green I 会不会干扰PCR反应?

请教各位高手,SYBR Green I 会不会干扰PCR反应?


本人近来碰到一奇怪问题,就是在普通PCR仪上做PCR,得到单一条带大约在500bp,但是加入SYBR Green I后还是在此机器上(其他条件都相同),却出现了一条200bp的杂带,已排除污染的可能,我想请教各位高手,是否SYBR Green I 会降底引物的Tm值,使它产生错配,或还有其他原因,有否介绍SYBR Green I的文章?谢谢!
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韩梅梅[使用道具]
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SYBR Green I
不是显色用的染料吗吗?
类似EB的作用,怎么会掺到PCR体系中去?
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冷太阳[使用道具]
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是不是做荧光定量PCR啊?
不需要专门的荧光定量PCR仪吗?
下面是几个protocol,和一些相关资料的网址,看看是不是有用。
SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR
qPCR™Mastermix for Sybr™ Green I

SYBR® Green JumpStartTM Taq ReadyMixTM: Lights Your Way To Quantitative PCR
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fangxiang[使用道具]
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我糊涂了,
SYRB是一种新型核酸染色显色剂
安全,不致癌,
灵敏度和EB差不多,
效果很好,
颜色类似丫啶橙的颜色,
也很好看。

怎么又变成定量PCR了?
看来有误会,还是让楼主把把问题说说清吧。
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楼主把SYSBR Green I加入PCR反应,那么不是想做荧光定量PCR吗?
不然干吗要把染料加入PCR反应体系中?
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微笑的海豚[使用道具]
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我糊涂了,
SYRB是一种新型核酸染色显色剂
安全,不致癌,
灵敏度和EB差不多,
效果很好,
颜色类似丫啶橙的颜色,
也很好看。

怎么又变成定量PCR了?
看来有误会,还是让楼主把把问题说说清吧。


没错SYRB是一种核酸染料,其实也并不怎么新,早就有了,只是价格比较贵,常规电泳犯不着用它。但因其高灵敏度(最低可以检测到 20pg 的 dsDNA,灵敏度比 EB 高出 25 到 100 倍),使其用于扩增产物的检测非常理想。
SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点,由于它与所有的双链DNA相结合,不必因为模板不同而特别定制,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低。此外,由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合,因此SYBR Green I的灵敏度很高。
但是,由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。(相信楼主的问题就在这喽!)
通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。
现在很多的实时PCR Kit用的显料都是SYBR Green I,包括Qiagen的QuantiTect SYBR Green PCR Kit,stratagene的Brilliant® SYBR® Green QPCR Core Reagent Kit和LightCycler。
这是Qiagen的一份资料。
Improvements in Quantitative PCR and RT-PCR Using SYBR Green
我前面帖子中最后的链接是sigma的资料。

记得以前我发过一个帖子:Equipment And Reagents For Real-Time PCR就介绍了这方面的内容。


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感谢各位的答复,可能是我没把问题讲清楚,我再补充一下。
我是想做IL-20的定量PCR,在普通pcr仪上先摸条件,已经全部摸好了,为500bp的单一条带,然后在同样条件下加入荧光染料SYBR Green I 后在BIO-RAD公司的定量PCR仪上做定量,之后又做了熔点曲线(melt curve),再拿产物跑电泳,结果为:
1、熔点曲线提示有杂峰;
2、经电泳判断杂峰不是由引物二聚体引起,而是出现了200bp的杂带,但是阴性对照提示没有污染
于是想到在条件和内容物完全一样的情况下,就多加了一个荧光染料SYBR Green I和校正液(BIO-RAD
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感谢各位的答复,可能是我没把问题讲清楚,我再补充一下。
我是想做IL-20的定量PCR,在普通pcr仪上先摸条件,已经全部摸好了,为500bp的单一条带,然后在同样条件下加入荧光染料SYBR Green I 后在BIO-RAD公司的定量PCR仪上做定量,之后又做了熔点曲线(melt curve),再拿产物跑电泳,结果为:
1、熔点曲线提示有杂峰;
2、经电泳判断杂峰不是由引物二聚体引起,而是出现了200bp的杂带,但是阴性对照提示没有污染
于是想到在条件和内容物完全一样的情况下,就多加了一个荧光染料SYBR Green I和校正液(BIO-RAD公司的定量PCR仪做染料法要加一本底染料称为校正液),于是就想到是否此二物质干扰了PCR反应,就做了以下的实验:
1、还是在原来普通PCR仪上,条件一样
2、分5组,每组做两管,分别为第一组:阴性,即不加模板,但加SYBR Green I和校正液,第二组:阳性,加模板,不加SYBR Green I和校正液,第三组只加SYBR Green I,第四组只加校正液,第五组加SYBR Green I和校正液。
电泳结果为第一组无条带,第二组只有500bp的条带,与以前的结果一致,第三组有200bp杂带,第四组同第二组,第五组有杂带,从而得出是SYBR Green I干扰了PCR反应,但奇怪得是我以前用染料法做其他得基因从没碰到过这样的问题,所以想请教各位高手,有何办法解决?其中也曾考虑过换一个引物,但是IL-20的cDNA也只有500bp多一点,考虑到夸内含子的问题很难换。
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我没做过这方面的实验,只是看过一 些资料而已,不能为你提供什么好的建议。但有一点我不太明白,做定量PCR又不需要进一步做表达,为什么要扩增500bp(差不多cDNA全长)?这样引物设计是不是也比较麻烦啊,不容易找到条件很好的引物吧?我想是不是可以不要扩那么长,但引物的特异性好些呢?
具体的相信园子里有做这方面的高手,让他们出出主意,其实你也可以联系公司的技术员问一下吗。
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缘yuan[使用道具]
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是考虑过换引物,但只有拉500bp才夸内含子,因为怀疑RNA中混有DNA,所以要夸内含子。不知对不对?
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