小中大感谢各位的答复,可能是我没把问题讲清楚,我再补充一下。
我是想做IL-20的定量PCR,在普通pcr仪上先摸条件,已经全部摸好了,为500bp的单一条带,然后在同样条件下加入荧光染料SYBR Green I 后在BIO-RAD公司的定量PCR仪上做定量,之后又做了熔点曲线(melt curve),再拿产物跑电泳,结果为:
1、熔点曲线提示有杂峰;
2、经电泳判断杂峰不是由引物二聚体引起,而是出现了200bp的杂带,但是阴性对照提示没有污染
于是想到在条件和内容物完全一样的情况下,就多加了一个荧光染料SYBR Green I和校正液(BIO-RAD公司的定量PCR仪做染料法要加一本底染料称为校正液),于是就想到是否此二物质干扰了PCR反应,就做了以下的实验:
1、还是在原来普通PCR仪上,条件一样
2、分5组,每组做两管,分别为第一组:阴性,即不加模板,但加SYBR Green I和校正液,第二组:阳性,加模板,不加SYBR Green I和校正液,第三组只加SYBR Green I,第四组只加校正液,第五组加SYBR Green I和校正液。
电泳结果为第一组无条带,第二组只有500bp的条带,与以前的结果一致,第三组有200bp杂带,第四组同第二组,第五组有杂带,从而得出是SYBR Green I干扰了PCR反应,但奇怪得是我以前用染料法做其他得基因从没碰到过这样的问题,所以想请教各位高手,有何办法解决?其中也曾考虑过换一个引物,但是IL-20的cDNA也只有500bp多一点,考虑到夸内含子的问题很难换。