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标题:PCR的注意点----PCR初学者

雪山飞狐[使用道具]
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PCR的注意点----PCR初学者

PCR的注意点----PCR初学者[转载]


我是一名初学者,由于语言交流的问题,我的老师无法详细给我解答一些问题,求助于各位大哥大姐,先谢了。
我在做一个X-link疾病的基因,目前是根据每个外显子先PCR,然后再电泳验证,可是我在做的过程中我自己觉得已经比较严格地按照老师的步骤去做,可是电泳的是还是经常失败,经常是阳性对照(正常DNA)无法显示,而且有些电泳看起来可以的,在分光光度计测量是230/260经常是2.1左右,或者浓度太低显示不出,我知道我提的问题很浅,但我很想知道在这些PCR过程中哪些步骤是容易出错的,初学者应该特别注意哪些呢?急切盼望解答。
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大虾米[使用道具]
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引物--------不要轻信文献引物
自己设计个更好的  
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dior[使用道具]
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引物设计,模板、dNTP、引物浓度,反应条件等等这些会影响PCR结果,教材都有讲的,我就不罗嗦了。谈点自己的体会:
如果要做n管,就把除模板之外的其他部分按照n+1份配好,然后再分装,如:
10 x buffer 5ul
dNTP 4ul
引物1 1ul
引物2 1ul
taq酶 1ul
ddw 34ul
模板 2ul
共有9个模板,就把除模板外的其他成分乘10,即buffer50ul,dNTP 40ul ,引物1 10ul,引物2 10ul,taq酶10ul,ddw 340ul,加到一个离心管中,加盖,用力振荡使混匀(这步是必要的,否则分到各管中的体系步均匀,会影响结果,我第一次PCR就是因为没混匀结果没做出结果),稍稍离心一下,然后分装至9个PCR管中,每管48ul,在依次加入模板2ul,混匀,稍稍离心,上机。
还有就是吸取微量液体是,tip头尽量不用浸入液体太多,否则枪头外面附着的液体会影响加样的精确度。
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大虾米[使用道具]
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你这样容易一出全出,一不出全不出
我看在摸好条件前还是分着加把握
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雪山飞狐[使用道具]
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谢谢各位的解答,因为我的结果经常不稳定,今天我做的又成功了!我现在估计可能是我的蒸馏水出了问题。谢谢大家。
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大虾米[使用道具]
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蒸馏水出问题的可能性很小
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雪山飞狐[使用道具]
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我在用分光光度计测浓度时,为什么老是稀释40倍的时候测不出,而且260/280比值很大很大,而我不稀释却能测出,而且260/280比值很好,这是为什么呢?谢谢各位高手
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喵咪[使用道具]
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是否因为PCR产物的浓度过低,低于分光光度计所能检测的低限。
又:蒸馏水也会出问题的,虽然几率较小。本人就曾因蒸馏水的问题费了近两周的时间,才发现原来是这水在做怪。
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